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我们在实验初期,首先研究了使用流式细胞术检测BN大鼠Th1/Th2细胞群比例时使用刺激剂的最佳方案。从BN大鼠外周血中分离得到外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),联合不同浓度的刺激剂佛波醋(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA),离子霉素(lonomycin,Ion)及阻断剂布雷菲德菌素甲(BrefedliiiA,BFA)进行刺激培养,采用流式细胞仪四色配色方案,观察分析在不同刺激剂及阻断剂浓度下Th1/Th2的检测效率。当刺激剂浓度为PMA:75ng/mL、Ion:1.5 yg/mL,阻断剂浓度为 BFA:7.5 μg/mL 条件下,Th1/Th2 的检出率最高,为(0.56±0.04)%/(1.11±0.04)%,符合一般规律。而当刺激剂阻断剂浓度进一步增加时,Th1/Th2细胞的检测效率均发生明显的下降。另外在较低的浓度时检出率同样较低。根据上述实验结果,我们得到结论,低浓度的刺激剂及阻断剂,无法刺激T细胞活化从而达到提高检测效率的目的;而过高浓度的刺激剂及阻断剂,由于其本身所具有细胞毒性,可对细胞产生相应的损伤,同样降低检出率,影响实验测定的结果。根据上述分析,我们认为选择合适的刺激剂阻断剂浓度在流式实验中至关重要。虽然现在流式细胞术已经成为较为普遍的检测技术,有较为成熟小鼠及人类的检测方案及实验数据,而大鼠,尤其是BN大鼠的实验数据仍旧缺乏,这也是本次实验开展的意义所在。除此之外,由于Ion及PMA的使用可能会造成CD4分子的下调,以及在使用CD4细胞圈门时,所得到的细胞群体可能还包括NK细胞和双阴性的T细胞,所以我们在研究大鼠Th1、Th2细胞比例时还是选择CD3+CD8的设门方案。过敏性反应(Anaphylaxis)是一种严重威胁人类生命健康的多系统参与的综合征,其诱因是肥大细胞和嗜碱性粒细胞被激活后,于体循环中释放的多种炎症介质。依据反应是否有免疫系统的参与,如:是否存在免疫球蛋白的介导,分为免疫系统介导的过敏反应(allergic reaction),和非免疫系统介导的类过敏反应(anaphylactoid reaction)。五径甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)是一种小分子五碳呋喃化合物,是由果糖等五碳糖在高温时发生美拉德反应或焦糖化反应生成的副产物。现有的相关研究己证明,作为一种较为普遍的,糖类在高温下生成的副产物,多种含糖食物和中药注射剂中均含有5-HMF。另外,5-HMF在高温条件下很容易发生聚合反应形成二聚体,也就是双-(5-甲酷基糠基)醚(5,5-Oxydimethylenebis(2-furfural),OMBF)。根据本课题组前期研究,通过balb/c小鼠报告抗原腘窝淋巴结模型,我们证明了 5-HMF及OMBF能够造成过敏反应,并认为5-HMF在该过程中提供了一种共刺激信号,而OMBF则形成了新的抗原表位。另外通过RBL-2H3细胞实验我们也初步观察到了 5-HMF及OMBF能够引发类过敏反应及Ⅰ型超敏反应。基于以上内容,本研究利用动物实验继续对5-HMF及OMBF的可能引发的过敏性反应的类型做了进一步验证与探究,并对5-HMF及OMBF的体内蛋白结合情况进行了相关研究。首先,根据中国药典中对5-HMF在葡萄糖注射液中的限量要求,换算得大鼠的等效剂量,并以此为基础设计各项试验时的给药浓度。该部分研究内容包括四部分的试验内容:1)采用SPF级的雄性棕色挪威大鼠(Brown Norway,BN),170±20g,分别利用阳性药构建一型超敏反应动物模型和类过敏反应动物模型,确定各指标的检测技术方法及条件。摸索流式细胞术检测Ⅰ型超敏反应动物模型体内的Th1/Th2细胞群数目比例的相关条件;2)在上述实验条件下,开展5-HMF及OMBF直接诱导BN大鼠发生类过敏反应试验,通过观察动物的相关行为的改变、检测相关细胞因子的变化、结合相关病理切片的检测结果,研究5-HMF及OMBF诱发类过敏反应的能力;3)在上述实验条件下,开展5-HMF及OMBF诱导BN大鼠发生Ⅰ型超敏反应实验,通过观察动物的相关行为的改变、检测相关细胞因子的变化、结合相关病理切片的检测结果,以及利用流式细胞术检测Th1/Th2细胞群数目比例的改变,研究5-HMF及OMBF诱发Ⅰ型超敏反应的能力;4)通过检测5-HMF与OMBF与血浆蛋白结合的能力,并通过分子对接实验初步探索5-HMF及OMBF与人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)及牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)的结合能力。利用BN大鼠Ⅰ型超敏反应模型及类过敏反应动物模型,我们初步判定5-HMF与OMBF既能诱导BN大鼠Ⅰ型超敏反应又能诱导类过敏模型,且其引发类过敏反应的机制可能包括直接刺激肥大细胞脱颗粒或通过补体激活途径刺激肥大细胞脱颗粒。其引发的Ⅰ型超敏反应,可能通过IgE和IgG共同介导。在过敏反应中,两种低剂量组均显示出更强的效果。而在Ⅰ型超敏反应中,高剂量组的反应强度高于低剂量组。且在两类动物模型中均观察到二聚体OMBF的反应强度高于单体5-HMF。根据上述实验结果,我们推测5-HMF及OMBF可能在浓度较低时,在免疫球蛋白辅助,不激活免疫系统的情况下直接导致肥大细胞脱颗粒。而在较高剂量时,5-HMF和OMBF则作用于免疫系统,引起相关免疫球蛋白的释放,从而引发Ⅰ型超敏反应。另外血浆蛋白结合率实验提醒我们二聚体OMBF与血浆蛋白的结合能力更强,且在分子对接中显示出较强的结合反应,这也提醒我们二聚体可能有更强的毒性。前期有关过敏反应的研究总是将Ⅰ型超敏反应与过敏反应分开,很少有研究试图找到两个反应之间的联系。而根据我们的研究结果,我们发现了两种小分子化合物在体内模型上同时触发了两种反应,我们认为这两种反应之间的关系以及肥大细胞和免疫系统之间的相互调节作用值得进一步研究。过敏相关的不良反应是严重威胁人类生命健康的疾病之一。本研究致力于通过找到产品中常见的共有杂质成分,如5-HMF和OMBF,确定其引起过敏反应的能力及具体机制,明确其致敏的毒性,推动其在相关产品中的限量工作,以提高产品的安全性,并警告人们更仔细地使用含有此类物质的产品。本实验通过单次及30天反复给予食蟹猴静脉注射重组人凝血因子Ⅷ,观察可能出现的毒性反应类型和程度,为临床安全用药提供参考资料。单次急性毒性实验采用致死剂量法,一次静脉给药后,观察食蟹猴可能出现的急性毒性反应。长期毒性实验中连续给药30天,停药后恢复期观察四周,期间观察食蟹猴各项指标变化。急性毒性实验除61 250 IU·g-1剂量组动物给药后第14天乳酸脱氢酶(LDH)与药前相比升高外,其它各组均未见明显异常。30天连续给药实验中,出现与凝血因子麗抗体和抑制物相关的临床症状,但并未发现与给药明确相关的毒性病理改变。根据上述实验结果,食蟹猴单次静脉注射用重组人凝血因子Ⅷ的最大耐受剂量大于61250IU·kg-1;30天重复给药未见明显毒性反应剂量(NOAEL)为25IU·kg-1。