前言GSK3β是糖原合成激酶3(glycogen synthesis kinase, GSK-3)的亚型之一。近年来越来越多的研究证实,GSK3β不仅仅参与糖原代谢过程,它更是一个多功能激酶,在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化、细胞运动以及肿瘤发生等方面都扮演了重要角色。近来研究发现,GSK3β在乳腺癌的发生发展过程中起到了重要作用,并参与了乳腺癌细胞生长和细胞凋亡信号通路调控。但是,GSK3β是否参与了乳腺癌细胞的转移仍然是个有待于研究的问题。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族的重要成员。最近,p38MAPK信号通路因以正性调节的方式参与肿瘤的侵袭转移过程而倍受关注。为此,本研究检测了p-p38, p-GSK3βser9, GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达情况,并进一步研究GSK3β在乳腺癌侵袭中的作用以及GSK3β和p38MAPK通路的关系,为乳腺癌治疗提供相应的理论依据。材料与方法1、材料(1)细胞系人乳腺癌细胞系MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435s,原购自北京协和基础医学院细胞中心,本实验由中国医科大学已有的细胞复苏而得。(2)主要试剂鼠抗人p-p38抗体购自Cell signaling公司。兔抗人GSK3β抗体购自Bioworld公司。兔抗人p-GSK3pser9抗体购自Santa公司。p38MAPK特异性抑制剂SB203580购自美国Calbiochem公司。GSK3p特异性抑制剂SB216763购自Cayman公司。Transwell小室(孔径8um)购自Corning公司。2、方法(1) Western印迹法收集细胞加入RIPA buffer裂解液,超声处理,高速低温离心提取总蛋白,用Bradford法进行蛋白浓度测定。SDS-PAGE电泳,转印,封闭后加相应一抗、二抗。ECL发光,观察拍照,进行灰度值测定。(2)免疫荧光染色取对数生长细胞接种到孔板中。固定、TritonX-100处理、封闭后加相应一抗、二抗,复染细胞核,荧光显微镜观察拍照。(3) Transwell实验Transwell小室接种细胞后培养,擦去上室内细胞后固定,染色,观察拍照,进行细胞计数。3、统计学分析应用SPSS13.0统计软件行数据处理：采用t检验分析Western Blot图像灰度值、Transwell穿膜细胞数,用LSD-t检验对各样本均数行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、p-p38、p-GSK3βser9, GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达(1)Western印迹法检测,在三种乳腺癌细胞系MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435s中,p-GSK3βser9和p-p38的表达呈递增趋势,GSK3β表达无明显差别。(2)选取p-p38, p-GSK3βser9均高表达的高侵袭高转移细胞系MDA-MB-435s,免疫荧光定位显示：p-p38在MDA-MB-435s中主要表达在细胞核,细胞浆中仅有微弱的表达；而p-GSK3pser9在MDA-MB-435s中主要表达在细胞浆,细胞核中仅有微弱的表达。2、GSK3β抑制剂LiCL和SB216763作用MDA-MB-435s细胞系24h后p-GSK3βser9和GSK3β变化(1) Western印迹法检测显示：LiCL和SB216763均可上调p-GSK3βser9表达水平,GSK3P无明显变化。(2)免疫荧光定位显示：SB216763作用MDA-MB-435s细胞系24h后p-GSK3βser9胞浆表达减少,核表达增多。(3)Transwell实验显示：SB216763能浓度依赖性地增加乳腺癌细胞MDA-MB-435s的侵袭转移潜能。3、P38MAPK抑制剂SB203580对GSK3β活性的影响Western印迹法检测显示,SB203580浓度性依赖性的地下调MDA-MB-435s中p-p38, p-GSK3βser9蛋白的表达,但不影响GSK3β蛋白的表达。讨论GSK3β是一个多功能的蛋白激酶,它在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化和细胞运动等方面发挥重要作用。GSK3β的活性主要通过3种不同方式共同调节：(1)不同位点的磷酸化状态调节GSK3β活性。在N端丝氨酸9(Ser9)处磷酸化可降低GSK3β活性,而在酪氨酸216(Tyr216)处磷酸化则可增强它的活性；(2)细胞内定位调控GSK3β活性。GSK3β大部分存在于细胞质中,但转位入核后GSK3β对于细胞周期的调控、促进肿瘤发生的活性才得以发挥；(3)底物磷酸化水平的不同调控GSK3β活性。大部分GSK3β的底物都必须首先被其他激酶磷酸化(一次磷酸化),才能被GSK3β识别并受其磷酸化(二次磷酸化)。因此底物的磷酸化水平改变底物的可识别性,从而调控GSK3β的活性。目前,有关GSK3β对肿瘤的作用究竟是抑癌还是促癌,尚无定论。p38MAPK信号通路能通过磷酸化作用激活多种转录因子,参与调节细胞反应,包括c-Jun, c-fos,和ATF2。活化的p38MAPK还可激活转录因子MEF2C、ELK-1、MAX和CHOP.另外,P38通路还参与细胞骨架蛋白的合成,应用p38MAPK抑制剂SB203580可抑制细胞的运动。本文通过观察GSK3β的活性变化对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,发现,随着乳腺癌细胞系MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435s侵袭力的增加,p-GSK3βser9蛋白表达呈递增趋势；而总GSK3β表达无明显差别,提示GSK3β活性与乳腺癌侵袭力负相关。Transwell实验结果显示,随着抑制剂GSK3β抑制剂SB216763的浓度增加,MDA-MB-435s细胞的侵袭力是逐渐升高的。也就是说GSK3β活性的降低可以增加乳腺癌细胞系MDA-MB-435s的侵袭能力。我们又进一步进行了乳腺癌细胞系免疫荧光定位,结果显示：p-GSK3βser9主要定位于细胞浆。而SB216763作用MDA-MB-435s细胞系24h后p-GSK3βser9核表达增多,浆表达减少。说明p-GSK3βser9可通过核内外运动来改变GSK3β的活性,进而调节乳腺癌细胞的侵袭能力。已证实,GSK3β在胞浆、胞核及线粒体内都存在,与胞浆相比,胞核及线粒体部位的GSK3β活性更高。胞核中的GSK3β调节了很多转录因子,其在胞核中水平不是恒定的,而是根据胞内一些因素的改变而发生剧烈变化。所以我们推测胞核中的GSK3β可能在调节乳腺癌侵袭基因方面发挥更为主要的作用。许多研究发现了GSK3β和P38MAPK存在一定的联系,那么两者在乳腺癌中的关系如何呢?我们采用不同浓度P38MAPK特异性抑制剂SB203580作用于MDA-MB-435s细胞系,实验结果显示：SB203580可以浓度依赖性地下调乳腺癌高转移细胞系MDA-MB-435s中pGSK3βser9蛋白表达水平。也就是说抑制P38MAPK通路可能直接或间接下调pGSK3βser9表达水平,从而增加GSK3β活性,进而在乳腺癌的侵袭中发挥一定的作用,但其确切机制有待于进一步研究。我们的结果显示,抑制GSK3β活性可以促进乳腺癌细胞系的侵袭能力,并且在乳腺癌细胞系中GSK3β和P38MAPK之间呈负相关。目前,GSK3β和p38MAPK信号通路抑制剂成为肿瘤治疗的热点,我们实验结果为GSK3β和p38MAPK作为乳腺癌治疗的靶点提供了新的理论依据。结论1、GSK3β活性的抑制可以增加乳腺癌细胞系的侵袭能力。2、乳腺癌细胞系中GSK3β活性与p38MAPK呈负相关。