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真藓科Bryaceae植物的分子系统学研究是藓类植物研究中的新热点,RAPD是分子系统学研究中被广泛采用的一项重要技术。在真藓科Bryaceae中,丝瓜藓属Pohlia的位置、大叶藓属Rhodobryum属的地位和真藓科Bryaceae内几个属的系统排列关系一直存在争议。为了对上述问题进行探讨,本研究建立了真藓科Bryaceae植物RAPD的反应体系,构建了真藓科Bryaceae植物RAPD图谱,并利用RAPD图谱对真藓科Bryaceae植物进行了系统发育分析。
通过比较DNA提取方法,本研究选择快速提取试剂盒成功提取所有标本基因组DNA,所提DNA完整性好,纯度高,能够满足RAPD的要求。通过单因素和正交试验对影响RAPD的因素进行考查,建立了优化的RAPD反应体系:dNTP为0.2mmol/L,随机引物0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.25U,Mg<2+>为2mmol/L,模板DNA为50ng,扩增体系为25μl。扩增程序为:95℃预变性7min,然后94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,40个循环,72℃终延伸7min。以优化出来的PCR条件和PCR体系以标本Y1、Y2、Y3所提DNA为模板对250条引物进行筛选扩增,35条扩增稳定、富有多态性的引物被筛选出来。
采用上述35条引物对40份标本所提DNA进行扩增,最终采用26条引物构建RAPD图谱,共扩增出198条稳定的条带,分子量在200bp~5,000bp之间,平均扩增条带7.61条,其中181条为多态性条带,占91.41%。表明该图谱能够反映出所研究类群的遗传多态性,可以作为系统发育分析的依据。
采集RAPD多态性信息,运用系统进化分析软件PAUP4.0b8分别采用MP法、NJ法、UPGMA法对多态性信息进行分析,构建了MP、NJ、UPGMA系统发育树。所揭示的系统发育关系与传统划分并不一致,部分结果支持基于分子序列的研究结果。
系统发育分析的结果显示:丝瓜藓属Pohlia更接近于提灯藓科Mniaceae而远离真藓科Bryaceae的类群,支持Cox等分子序列证据将丝瓜藓属Pohlia放在提灯藓科Mniaceae的安排;大叶藓属Rhodobryum与真藓属Bryum作为姊妹群存在,不支持Ochi将其作为真藓属Bryum内一个亚属的安排。真藓科Bryaceae和真藓属Bryum均为多系群,认为传统分类对一些类群的划分存在争议。可见RAPD可以为真藓科Bryaceae植物的系统发育研究提供分子证据,真藓科Bryaceae植物的系统发育关系有待进一步研究。