背景:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种常见的血管疾病,同时是心脑血管病发生的重要危险因素,随着人们生活方式的改变,AS的发病率逐年增高,已经严重威胁人类健康。山花消脂方（SHXZF）是导师根据《清宫医案集成》中茶饮方“加味三仙饮”加减化裁而来,在降低血脂水平、改善AS患者内膜中层厚度等方面有较好的临床疗效。本课题组前期实验研究证明,SHXZF能够降低高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠总胆固醇和甘油三酯的水平,改善脂质沉积,延缓AS的进展,但其作用机制尚不明确。本研究基于整合药理学方法,对SHXZF治疗AS的作用机制进行探索。目的:基于整合药理学方法,采用UPLC-ESI-QTOF-MSE技术对SHXZF有效化学成分进行初步鉴定,运用网络药理学方法分析SHXZF有效化学成分发挥抗AS作用的靶点及分子生物功能;运用蛋白质组学技术分析SHXZF作用于AS的差异表达蛋白;整合网络药理学与蛋白质组学研究结果,分析SHXZF治疗AS的关键核心靶点及关键通路,探索SHXZF治疗AS的作用机制。方法:1.SHXZF成分鉴定及抗AS的网络药理学研究根据研究文献并运用TCMSP数据库、化学专业数据库构建SHXZF所含药物的化学成分数据库;将SHXZF的组成药物按比例煎煮并浓缩至生药量为0.8g/ml的水煎液,在超高液相色谱质谱仪中完成分析;将结果与化学成分数据库中的成分信息对比,同时根据参考文献、Mass bank数据库提供的碎片裂解信息鉴定出化合物。利用TCMSP数据库、Symmap数据库、TTD数据库查找上述化合物的候选靶点,整合去重,得到SHXZF化学成分调控的基因靶标;检索DisGeNET数据库、GeneCards数据库中AS的靶点,合并取交集获得AS的重要相关靶点;运用jvenn在线工具对化学成分候选靶点与AS疾病靶点进行分析,获得SHXZF治疗AS的关键靶点;分析上述关键靶点对应的化学成分,并运用Cytoscape3.7.1软件构建“药物-化合物-靶点”网络;运用DAVID数据库对SHXZF治疗AS的关键靶点进行功能富集分析。2.SHXZF治疗AS的蛋白质组学研究20只ApoE-/-小鼠随机分为模型组和中药组,每组10只,采用高脂饲料喂养。模型组小鼠予生理盐水灌胃,中药组予SHXZF水煎液灌胃,8周后取小鼠主动脉弓用于提取蛋白。蛋白定量检测提示合格后进行蛋白酶解及TMT标记,然后对样品进行LC-MS/MS分析,获得的数据通过Proteome Discoverer软件进一步分析。按照Score Sequest HT＞0且Unique Peptide≥1,并去除空白值的标准筛选可信蛋白。随后设置差异筛选条件为Foldchange=1.5倍且p-value＜0.05,最终得到差异表达蛋白。利用DAVID数据库对筛选获得的差异蛋白进行GO、KEGG Pathway 分析。3.网络药理学与蛋白质组学联合分析网络药理学预测的SHXZF抗AS靶点和蛋白质组学得到的差异表达蛋白取交集,获得网络药理学和蛋白质组学的共表达靶点,即SHXZF抗AS的关键核心靶点;筛选关键核心靶点对应的化合物,运用Cytoscape3.7.1软件构建化合物与关键核心靶点的共表达网络,通过网络拓扑分析获得SHXZF抗AS的重要化合物;Western blot方法验证相关蛋白的表达水平。结果1.SHXZF成分鉴定及抗AS的网络药理学研究经质谱分析,共鉴定出SHXZF 14个化学成分,并通过TCMSP数据库、Symmap数据库、TTD数据库获得14个化学成分的833个候选靶点;通过DisGeNET数据库和Genecards数据库获得AS相关的疾病靶点1559个;运用在线工具jvenn,获得363个SHXZF治疗AS的候选靶点;构建“药物-化合物-靶点”网络并进行网络分析,根据degree值判断,芹菜素、山奈酚、柚皮苷、芦丁、柚皮素、隐绿原酸和橙皮素可能是SHXZF治疗AS的关键有效化合物;对363个SHXZF治疗AS的候选靶点进行GO和KEGG富集分析,得知SHXZF抗AS的分子功能主要体现在与酶的结合活性方面;生物学过程主要涉及对炎症反应以及平滑肌细胞增殖的调控;细胞组成主要涉及细胞外空间,胞质、质膜外侧和细胞外泌体等;SHXZF发挥抗AS的作用可能是通过炎症通路如TNF信号通路、TOLL样受体信号通路、HIF-1信号通路、NF-KappaB信号通路,影响血管内皮细胞功能的通路如cAMP信号通路、VEGF信号通路和脂质代谢相关的通路如PPAR信号通路。2.SHXZF治疗AS的蛋白质组学研究选择小鼠主动脉弓用于提取蛋白,每组3个蛋白样品进行检测,经验证蛋白浓度满足实验要求。样品经LC-MS/MS检测分析后,获得蛋白定性定量统计结果,以protein FDR＜0.01,peptide FDR＜0.01为筛选条件最终鉴定得到3991个蛋白,283 88 个肽段。根据 Score Sequest HT＞0 且 unique peptide≥1,并去除空白值的标准筛选得到可信蛋白3324个。以Foldchange（FC）=1.5倍且p-value＜0.05为筛选条件,对模型组与中药组组间差异表达蛋白进行比较,获得167个差异表达蛋白,其中129个蛋白表达上调,38个蛋白表达下调。差异表达蛋白GO功能富集分析结果提示相关蛋白主要参与了氧化还原过程、心肌收缩过程以及对锌离子的反应过程;主要包含了线粒体、线粒体内膜、过氧化物酶体、分泌颗粒等;同时具有结合钙离子、铁离子和血红素等分子功能;KEGG富集分析结果显示,相关蛋白参与了脂质代谢相关途径包括类固醇激素生物合成、PPAR信号通路;碳水化合物代谢相关通路包括抗坏血酸和醛糖代谢途径、果糖和甘露糖代谢途径;循环系统包括心肌收缩途径。3.网络药理学与蛋白质组学联合分析通过jvenn在线工具绘制网Venn图,获得网络药理学363个靶点与蛋白质组学142个差异表达蛋白之间存在12个共靶点,被认为是SHXZF抗AS的关键核心靶点。提取12个关键核心靶点对应的化合物,构建成分-靶点网络并进行网络拓扑分析,以degree值为判断依据,并结合研究一网络药理学结果,提示芦丁和橙皮素是SHXZF发挥抗AS作用的主要化合物;网络药理学与蛋白质组学生信分析结果中交叠的KEGG通路是PPAR信号通路,被认为是SHXZF治疗AS的关键通路,12个关键核心靶点中LPL和SCD在PPAR信号通路中表达下调,Western Blot验证结果表明,SHXZF能够下调ApoE-/-小鼠主动脉组织中LPL蛋白和SCD蛋白表达水平。结论1.SHXZF中活性化合物芦丁和橙皮素可能是治疗AS的主要有效成分。2.SHXZF通过多靶点、多途径发挥抗AS的作用,其机制可能是通过抑制PPAR信号通路中LPL和SCD基因的表达,抑制脂肪酸的合成,调节体内脂质代谢水平,从而发挥抗AS的治疗作用。