两种视网膜下新生血管小鼠模型基因表达谱的RNA-Seq研究

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目的:Vldlr基因敲除小鼠和激光诱导脉络膜新生血管的小鼠模型是研究年龄相关性黄斑变性的重要工具,但引起它们视网膜下新生血管(SNV)早期分子水平改变的机制尚未完全明确。本文基于RNA测序(RNA-Seq)技术,对这两种SNV小鼠模型视网膜进行转录组测序及生物信息学分析和验证。  方法:分别取16天龄Vldlr-/-小鼠和野生型C57小鼠视网膜组织各3只,使用TRIzol和酚氯法提取视网膜总RNA。另外,使用Nd:YAG激光构建激光诱导CNV小鼠模型后,用同样的方法提取3只激光诱导CNV小鼠视网膜总RNA。在Illumina HiSeq2000平台上对6个样本所建的cDNA文库按每个样本200万条100bp行末端配对法(pair-end)进行测序,所得读数用Bowtie2.0.7版本比对到小鼠的全基因组序列(UCSC版本mm10)上,剪接接头用TopHat2.0.8版本进行识别。RNA-Seq数据的定量和基因差异表达分析R语言包GenomeRanges、libSamtools和EdgeR完成。PANTHER、DAVID、Cytoscape、STRING、BINGO、GeneMania等生物信息学软件以及EXCEL软件综合分析,系统评价了SNV差异表达基因的功能分类。利用qPCR对7个与SNV相关的基因进行mRNA表达水平的验证。  结果:选取假发现率FDR<0.05和编码蛋白基因为过滤标准,与对照组相比,Vldlr-/-小鼠视网膜共检测到1204个差异表达的基因中,763(63%)个基因表达上调,而441(37%)个基因表达下调,生物信息学分析预测这些因子主要参与眼的发育、翻译过程、黑色素合成和氧化磷酸化等生物学过程。激光诱导CNV小鼠视网膜共检测到1399个差异表达的基因中,1092(78.1%)个基因表达上调,而307(21.9%)个基因表达下调,这些基因主要参与趋化因子或细胞因子诱导的炎症反应、细胞凋亡、视觉感知等生物学过程。选择符合FDR<0.05,Log2FC≥2的基因作为进一步筛选标准,两组数据中共存的差异表达基因27个,运用生物信息学技术对分子功能(MF)、生物学过程(BP)和信号通路(pathway)进行分析显示它们主要参与血管发育、新生血管形成、蛋白质结合等生物学过程。qPCR结果显示RNA倍数的变化与RNA-Seq结果相比,两者变化方向一致。  结论:Vldlr基因敲除小鼠和激光诱导脉络膜新生血管小鼠均是研究视网膜下新生血管形成良好动物模型,我们采用RNA-Seq技术对这两种SNV小鼠模型视网膜进行测序,揭示了其视网膜下新生血管形成早期的分子变化,筛选出大量差异表达基因。同时,通过生物信息学各类软件进行基因本体论和聚类分析显示两个动物模型27个共同差异表达基因与视网膜下新生血管形成密切相关,但这些基因的功能需要进一步研究。视网膜下新生血管形成的分子机制还不清楚,本研究筛选出的差异表达基因为进一步探索其分子机制和治疗靶点提供了新的研究线索,同时这些有用的信息也为今后的研究奠定了实验基础。
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