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目的:食管癌(esophageal cancer, EC)是一种高恶性度肿瘤,其发病率在各种恶性肿瘤中位居第9。90%的食管癌患者一经发现就已是晚期。在过去的研究中,我们已经对食管癌的分子生物学改变有了一定的认识,然而,对食管癌发生发展的确切机制仍然不清楚。OLC1(overexpressed in lung cancer)是通过高通量实验筛选出的一个肺癌相关新基因,目前尚无OLC1基因功能研究的报道。我们的前期研究结果显示其在人食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)组织中高表达,特别是在食管癌发生的早期。这一发现提示,OLC1的过表达可能在人食管鳞癌的发生发展过程中发挥作用。但目前还没有证据表明OLC1与人食管鳞癌细胞凋亡之间有直接的关系,因此我们就OLC1抑制肿瘤细胞凋亡及其分子机制展开研究。方法: 1.本研究将pEGFP-OLC1质粒稳定转染内源性OLC1表达相对较低的人食管鳞癌细胞KYSE150,应用Western-bolt方法筛选并建立OLC1稳定高表达细胞系。通过体外表型实验(如生长曲线、克隆形成和transwell)评估外源过表达OLC1对人食管鳞癌细胞增殖、粘附和迁移能力的影响。进一步,我们将pGCsi -OLC1质粒稳定转染内源性OLC1表达相对较高的食管鳞癌细胞EC9706,沉默OLC1的表达,建立OLC1基因干扰细胞系,反向验证OLC1对食管鳞癌细胞生物学表型的影响。2.应用一系列细胞凋亡检测方法,如DAPI染色、DNA Ladder、末端脱氧核苷酰转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TdT-mediated biotinylated-dUTP nick end labling, TUNEL)及流式细胞术(flow cytometry analysis, FCM)检测OLC1高表达对顺铂和紫外照射(Ultraviolet radiation, UVR)诱导细胞凋亡的影响,同时在OLC1基因干扰细胞系中反向验证。并用Wester-bolt检测凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2表达改变情况。3.在EC9706/pGCsi-OLC1细胞系中,应用特异性针对BRCA1的干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)沉默BRCA1表达,通过DAPI染色和Western-blot等实验进一步探讨OLC1影响细胞凋亡的分子机制。结果: 1.实验结果显示,外源过表达OLC1对人食管鳞癌细胞增殖和粘附能力均有促进作用,但对迁移能力无明显影响。而且OLC1表达被沉默后导致食管鳞癌细胞增殖能力明显降低。2.一系列细胞凋亡检测方法的结果表明,OLC1高表达能够抑制顺铂和紫外照射诱导的细胞凋亡,同时在OLC1基因干扰细胞系中也得到了反向验证。进一步在分子水平上检测,OLC1高表达使凋亡相关蛋白Caspase-3酶原剪切减少和Bcl-2蛋白稳定性增加。而且OLC1基因干扰后,细胞对凋亡刺激的敏感性明显增加,同时促进了Caspase-3蛋白的剪切和Bcl-2蛋白表达降低。3.Western-blot检测表明,在OLC1高表达细胞中,BRCA1蛋白明显下调;而在OLC1基因干扰细胞中,BRCA1呈上调表达。我们另外的研究说明,OLC1高表达引起BRCA1下调是通过转录后调节机制;Pulldown、IP实验也证实,二者之间存在着直接的相互作用。因此,我们通过干扰了BRCA1的表达进一步研究OLC1影响细胞凋亡的分子机制。实验证实, BRCA1被干扰后,与对照组相比, BRCA1干扰组的凋亡细胞明显减少。接下来采用Western-blot方法分析BRCA1-siRNA对细胞凋亡的影响。检测到BRCA1-siRNA转染有效的抑制了BRCA1蛋白的表达,在一定程度上抑制了Caspase-3的剪切并且增强了Bcl-2的稳定性。结论:综上所述,我们的研究首次证明了,OLC1高表达促进人食管癌细胞的增殖能力,降低凋亡敏感性。OLC1基因干扰导致细胞的增殖能力降低,凋亡敏感性增加。研究结果初步探讨了OLC1高表达抑制细胞凋亡分子机制之一是下调BRCA1的表达。过表达OLC1通过下调BRCA1的表达,从而引起其下游靶基因Bcl-2稳定性的增加,进而抑制Caspase-3的激活,最终抑制细胞凋亡的发生。同时提示OLC1高表达下调BRCA1蛋白有可能影响了BRCA1与Gadd45α或p53蛋白的相互作用,三者共同参与了OLC1过表达引起的细胞凋亡抑制的调控。OLC1异常表达诱发人食管鳞癌细胞增殖与凋亡的失调,提示OLC1在人食管癌发生发展过程中有重要的作用。