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目的：⑴构建携带人YB1基因的腺病毒表达载体(AdYB1)和针对YB1的siRNA的腺病毒表达载体(AdsiYB1),并鉴定其生物学功能。⑵确定三氧化二砷可诱导乳腺癌细胞株MCF-7和人胃癌细胞株BGC-823发生自噬,并寻找诱发自噬的最适用药浓度。⑶用三氧化二砷诱导感染了AdYB1的MCF-7细胞和感染了AdsiYB1的BGC-823细胞发生自噬,从正反两方面证明YB1可抑制三氧化二砷诱导的肿瘤细胞自噬。⑷探索YB1抑制的三氧化二砷诱导的肿瘤细胞的自噬对细胞死亡的影响。
方法：①Trizol法提取人白血病细胞K562的总RNA后,利用RT-PCR技术扩增目的片断YB1；使用T4连接酶连接BglⅡ及HindⅢ双酶切后的目的片断YB1与pAdTrack—CMV,鉴定并扩增正确重组腺病毒穿梭质粒(pAdTrackCMV-YB1)；合成能高效干扰BGC-823细胞的YB1表达的ShRNA并将其插到穿梭质粒pShuttle-H1的启动子下游,鉴定含正确目的基因的重组腺病毒穿梭质粒(pAdShuttle-H1-siYB1)克隆；分别将正确的阳性克隆穿梭质粒pAdTrack—CMV-YB1和pAdShuttle-H1-siYB1转入含有质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌进行同源重组,鉴定、扩增；应用脂质体分别将成功重组的腺病毒载体质粒pAdEasy-YB1和pAdEasy-siYB1转入293A细胞中进行包装、扩增,病毒滴度测定获得具有高感染效能的腺病毒表达载体AdYB1和AdsiYB1。将腺病毒AdYB1感染MCF-7细胞,AdsiYB1感染BGC-823细胞,经RT-PCR和Western blot方法检测干扰前后MCF-7细胞和BGC-823细胞YB1基因和蛋白的表达量的变化。②用梯度浓度的As2O3处理MCF-7细胞和BGC-823细胞,MTT法测定As2O3对MCF-7和BGC-823细胞系增殖的抑制作用；并用Western blot方法测定在梯度浓度的As2O3作用下两种细胞的自噬标记蛋白LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达情况,以确定诱导自噬的最适用药浓度。③As2O3作用于AdYB1感染的MCF-7细胞及AdsiYB1感染的BGC-823细胞,用anti-LC3免疫荧光染色,MDC自噬特异性染料行荧光染色,Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达的方法综合评价YB1对As2O3诱导的细胞自噬的影响。④用As2O3诱导感染了AdsiYB1的BGC-823细胞发生自噬前2h用3-MA(10mM)预处理细胞,Western blot方法检测LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达以证实3-MA对自噬的抑制作用。MTT法分别检测加或不加3-MA时,不同浓度的As2O3对BGC-823的细胞毒性及AdsiYB1对它的影响,并计算各组的IC50。
结果：⑴RT-PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增片断为1019bp,与目的片断大小符合。腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-YB1经BglⅡ及HindⅢ双酶切后电泳见大约9kb(质粒骨架)和1019bp(YB1基因)2个片段,与目的片断符合,测序结果表明克隆得到的序列与GenBank中YB1序列一致。同源重组腺病毒质粒pAdEasy—YB1经PacⅠ酶切后电泳,可见约4.5kb和30kb左右的电泳带各一条。重组腺病毒质粒经293A包装扩增获得高感染效率的重组腺病毒AdYB1,病毒滴度为2.5×109pfu／ml,该重组腺病毒能显著提高MCF-7细胞的YB1的mRNA及蛋白的表达水平；穿梭载体pShuttle—Hl插入序列及重组腺病毒质粒的鉴定均完全正确。经293A包装扩增获得高感染效率的重组腺病毒AdSiYB1,病毒滴度为5×109 pfu／ml。该重组腺病毒能显著抑制BGC-823细胞中YB1mRNA及蛋白的表达。⑵MTT法检测结果表明As2O3可明显抑制MCF-7细胞和BGC-823细胞的增殖活性,呈现明显的剂量效应关系。其IC50分别为4.59μ M和6.53μ M。Western blot检测可见在2μ mol／L的As2O3处理的MCF-7细胞中和4μ mol／L的As2O3处理的BGC-823细胞中,P62蛋白降解显著,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达均有增加,且LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ增加更强且更加明显。提示As2O3能诱导MCF-7细胞和BGC-823细胞发生自噬。⑶转染了AdYB1的MCF-7细胞相对与对照组AdGFP转染的MCF-7细胞而言,由AS2O3诱导的自噬被抑制。表现为anti-LC3免疫荧光染色红色荧光强度降低及点状集聚减少。MDC染色蓝紫色荧光强度减弱及荧光颗粒减少。Western blot检测示AdYB1抑制了As2O3诱导的细胞内LC3-Ⅱ蛋白的聚集和P62的降解。相反,转染了AdsiYB1的BGC-823细胞相对与对照组Adsicontrol转染的BGC-823细胞而言,由As2O3诱导的自噬进一步增加。表现为anti-LC3免疫荧光染色红色荧光增强及点状集聚增加。MDC染色蓝紫色荧光增强及荧光颗粒增多。Western blot检测示AdsiYB1促进了As2O3诱导的细胞内LC3-Ⅱ蛋白的进一步聚集和P62的降解增多。⑷在感染AdsiYB1的BGC-823细胞中,加入预处理的3-MA后,与无义干扰组相比,原先因干扰YB1而降解的P62又重新积聚,且LC3总蛋白量及Ⅰ型向Ⅱ型的转换增加也均被抑制,证明自噬被抑制。干扰YB1可增加不同浓度的As2O3的细胞毒性。加入3-MA抑制自噬后As2O3的细胞毒性下降,说明As2O3诱导了细胞自噬性死亡,并且AdsiYB1组3-MA抑制细胞死亡的幅度大于Adsicontrol组。这种抑制效果的差异可能是因为YB1的表达的差异所导致。
结论：成功构建了携带人YB1基因的腺病毒载体AdYB1并能高效感染MCF-7细胞；成功构建针对YB1的SiRNA重组腺病毒载体AdSiYB1并能有效抑制BGC-823细胞的YB1表达。为进一步研究YB1的生物学功能打下基础。2.YB1能抑制As2O3诱导的肿瘤细胞自噬性死亡,为其诱导细胞耐药提出新的机制。