研究背景和目的：结直肠癌是全球范围内在女性中排在第二位，而在男性中排在第三位的恶性肿瘤。趋化因子及其受体在调节结直肠癌的生长、血管生成以及转移中发挥重大作用。Duffy抗原趋化因子受体(Duffy antigen receptor for chemokines, DARC)属于“沉默”趋化因子家族中的一员，它是位于红细胞以及内皮细胞等表面的一种糖蛋白,也是红细胞上的一种血型抗原，又称Duffy抗原。DARC基因序列的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP) rs12075位点形成了2个等位基因，分别为FY*A和FY*B，分别编码Duffy血型系统的Fya和Fyb抗原。DARC能特异性的结合一些促血管生成的趋化因子而不能启动趋化因子胞内信号传导通路，仅仅发挥清除趋化因子的作用。促进血管生成的趋化因子在结直肠癌的生长、血管生成、转移以及预后中发挥重要的作用。这提示DARC的表达或许和结直肠癌的发生、发展有关。结直肠癌遗传易感性因素包括染色体和微卫星不稳定性以及一些原癌基因和抑癌基因的分子突变以及SNP等。目前，许多研究已证实多种基因的SNP和结直肠癌易感性有关。有研究发现DARC的SNP位点rs12075与乳腺癌转移有关。这也提示DARC rs12075位点的基因多态性可能也与结直肠癌有关。随着DARC基因序列的阐明，很多基因分型方法，如聚合酶链反应-等位基因特异性引物（polymerase chain reaction with allele-specific primers, PCR-ASP)和聚合酶链反应-限制性片段多态性（polymerase chain reaction with restriction fragmentlength polymorphism，PCR-RFLP)等方法被用于DARC基因分型。然而这些方法均存在着需要电泳操作等缺点。因此开发一种新的简单、快速、高通量的DARC基因分型方法，将为研究DARC基因多态性和疾病的相关性以及在输血医学中鉴定Duffy血型的基因型提供一个有效的工具。本研究的目的是通过检测结直肠癌DARC、CD34以及金属基质蛋白酶-9（MMP-9）的表达，探讨结直肠癌DARC表达在结直肠癌中的作用。此外，建立一个用于DARC的SNP位点rs12075的基因分型的TaqMan-MGB探针实时PCR方法，对这个方法进行评价。并用该方法对结直肠癌和对照人群的DARC的rs12075位点进行基因分型，探讨DARC的rs12075位点基因多态性和结直肠癌的相关性。同时也分析DARC基因型和红细胞趋化因子清除功能以及表达的关系，从红细胞DARC表达和功能的角度，阐明DARC基因多态性影响结直肠癌的机制。方法：1.收集结直肠癌组织以及对照组织标本，应用实时PCR技术定量检测DARC的mRNA表达水平。应用免疫组织化学染色技术检测DARC、CD34以及MMP-9的蛋白表达。通过CD34的表达情况计数微血管密度（microvesseldensity, MVD）。2.设计针对DARC的SNP位点rs12075的TaqMan-MGB探针和引物，建立一个用于DARC基因分型的TaqMan-MGB探针实时PCR方法。用建立的方法对120个样本进行基因分型。并将该基因分型方法和PCR-ASP方法进行比较。此外，确定该方法的最低检出限和重复性。3.收集结直肠癌和对照人群血样，应用建立的DARC基因分型方法对血样进行基因分型。应用流式细胞术检测不同DARC基因型的红细胞表面DARC的表达。应用ELISA技术检测不同DARC基因型的红细胞趋化因子清除能力。结果：1.结直肠癌组织和正常结直肠组织中DARC蛋白和mRNA的表达在90例结直肠癌组织中，DARC蛋白表达阳性66例（73.3%），64例正常结直肠组织DARC的蛋白表达均为阳性（100%）。结直肠癌组织DARC表达阳性率要显著低于正常结直肠组织(P<0.001)。结直肠癌组织DARC的mRNA表达水平要显著低于正常结直肠组织(P=0.012)，平均降低4倍。无论在结直肠癌组织还是在正常结直肠组织，DARC蛋白表达水平和mRNA表达水平呈正相关(P<0.001)。2.结直肠癌组织DARC蛋白表达和病理特征的相关性DARC蛋白表达与淋巴结转移状态以及TNM分期呈负相关(P＜0.05)，而与肿瘤分化程度呈正相关(P＜0.001)。未发现DARC蛋白表达与其它特征如年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度肿瘤部位以及远处转移等有关。3.结直肠癌组织和正常结直肠组织中MMP-9的表达在90例结直肠癌组织中，MMP-9蛋白表达阳性72例（80.0%），在64例正常结直肠组织中，DARC的蛋白表达阳性33例（51.6%）。结直肠癌组织MMP-9表达阳性率要显著高于正常结直肠组织(P＜0.001)。4.结直肠癌组织MMP-9表达和病理特征的相关性MMP-9表达与淋巴结转移状态以及TNM分期呈正相关(P＜0.05)，而与肿瘤分化程度呈负相关(P=0.037)。未发现MMP-9表达和其它特征如年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度肿瘤部位以及远处转移等有关。5.结直肠癌组织MVD和病理特征的相关性MVD与淋巴结转移状态以及TNM分期呈正相关(P＜0.01)，而与肿瘤分化程度呈负相关(P=0.009)。未发现MVD和其它特征如年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度肿瘤部位以及远处转移等有关。6.结直肠癌组织DARC蛋白表达与MVD以及MMP-9表达的相关性结直肠癌组织DARC蛋白表达和MVD呈负相关(P＜0.001)，和MMP-9表达也呈负相关(P＜0.001)。MMP-9表达和MVD呈正相关(P＜0.001)。7. TaqMan-MGB探针实时PCR与PCR-ASP的比较TaqMan-MGB探针实时PCR与PCR-ASP方法的基因分型结果是完全一致的。8. TaqMan-MGB探针实时PCR的重复性及最低检出限选取5个基因型为FY*A/FY*A，5个基因型为FY*A/FY*B和1个基因型为FY*B/FY*B的样本进行TaqMan-MGB探针实时PCR的重复检测，结果和初次检测结果完全一致。对于纯合子FY*A/FY*A和FY*B/FY*B样本，TaqMan-MGB探针实时PCR的最低检测限是50pg，而对于杂合子FY*A/FY*B的最低检测限是100pg。9.大连汉族献血人群FY*A、FY*B的基因频率分布特点、Duffy抗原不配合机率及其与其它地区人群基因频率的比较在随机输血情况下，Fya抗原不配合的几率为0.1123，Fyb抗原不配合的几率为0.0044。二者合计不配合几率为0.1167。在大连汉族人群，FY*A基因频率高达93.3%，远高于FY*B的基因频率（6.7%）。大连汉族人群FY*A、FY*B的基因频率分布与国内其他地区汉族人群相比，无显著性差异，但与浙江畲族相比，有显著性差异(P=0.015)。10.结直肠癌病例组和对照组DARC基因型分布的比较在306例对照组人群中，基因型FY*A/FY*A为266例，FY*A/FY*B为39例。FY*B/FY*B为1例。在325例结直肠癌患者中，基因型FY*A/FY*A为286例，FY*A/FY*B为38例。FY*B/FY*B为1例。尚未发现DARC基因型和结直肠癌的发生有关。11. DARC基因型和结直肠癌患者的病理特征的关系在淋巴结转移阴性组DARC的基因型FY*A/FY*B和FY*B/FY*B组合的基因型频率（16.7%）高于淋巴结转移阳性组FY*A/FY*B和FY*B/FY*B组合的基因型频率（8.6%），而FY*A/FY*A的基因型频率（83.3%）要低于淋巴结转移阳性组的基因型频率（91.4%）(P=0.026)。基因型FY*A/FY*A的结直肠癌患者要比非FY*A/FY*A基因型的患者发生淋巴结转移的风险高2.137倍。12. DARC基因型和红细胞趋化因子清除功能的关系DARC基因型FY*A/FY*A的红细胞的CXCL8的清除能力要显著低于基因型FY*A/FY*B的红细胞（P=0.016）。DARC基因型FY*A/FY*A的红细胞的CCL2的清除能力要显著低于基因型FY*A/FY*B的红细胞（P=0.038）。13. DARC基因型和红细胞膜表面DARC表达的关系基因型FY*A/FY*A的红细胞表面DARC的表达水平明显高于基因型FY*A/FY*B的红细胞（P=0.021）。结论：1. DARC的表达在结直肠癌中是下调的，而这个下调可能参与了结直肠癌的发生进程。2. DARC的表达是与结直肠癌淋巴结转移、TNM分期、MVD以及MMP-9呈负相关，而与肿瘤分化呈正相关。3. DARC可能是通过降低微环境中促血管生成性趋化因子和MMP-9含量，抑制结直肠癌组织血管生成，进而抑制结直肠癌的进展和转移。4. DARC或许是结直肠癌生成、进展、血管生成以及转移的负性调节因子以及潜在的预后指标和分子治疗靶点。5. DARC的TaqMan-MGB探针实时PCR基因分型方法具有快速、简单、灵敏、重复性好、通量高、交叉污染风险小等特点，而且实现了结果自动判读，要优于传统的PCR-ASP方法。6.在大连汉族人群中，等位基因FY*A的基因频率占优势，要远远高于FY*B。大连汉族人群DARC基因频率分布特点和国内其他地区汉族人群相似，但和畲族DARC基因频率相比有显著性差异，提示DARC等位基因分布具有民族差异。7.在随机输血情况下，Fya和Fyb抗原不配合的机率为0.1167。这提示在临床输血时，因Duffy血型不合引起的免疫反应的风险不容忽视。8. DARC的rs12075位点基因多态性和结直肠癌的发生无关。9. DARC的rs12075位点基因多态性和结直肠癌的淋巴结转移以及TNM分期有关。基因型FY*A/FY*A结直肠癌患者相对于非FY*A/FY*A患者更易发生淋巴结转移。10. DARC的rs12075位点基因多态性影响红细胞DARC的蛋白表达。11. DARC的rs12075位点基因多态性影响红细胞趋化因子清除功能。12. DARC的rs12075位点的基因多态性影响结直肠癌淋巴结转移的机制可能是通过影响其编码的红细胞表面DARC结构，进而影响其清除血管生成性趋化因子的能力，从而影响结直肠癌的淋巴结转移。