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实验目的:MAGE是肿瘤特异性抗原CT抗原中的一大家族,它的发现为肿瘤的主动免疫治疗开创了一个新的纪元。多肽疫苗由于特异性强、副作用小、易于控制一直是肿瘤疫苗研究的热点,而MAGE家族因其在多种肿瘤细胞的特异性表达及在多种组织类型肿瘤细胞的广泛性表达成为多肽疫苗研究的首选。为此本实验克隆MAGE-4和MAGE-12用于制备单克隆抗体及多表位肿瘤多肽疫苗。 实验内容:从A375细胞和K562细胞中分别扩增得到MAGE-4和MAGE-12的全长cDNA并检测了MAGE-4、MAGE-12和NY-ESO-1在肿瘤细胞系和食管癌及肺癌组织中的表达,构建GST-MAGE-4原核表达载体,IPTG诱导表达MAGE-4蛋白,Western Blot鉴定蛋白并且通过BCA对蛋白定量。生物学软件进行抗原肽的理论预测和分析,为多克隆抗体、单克隆抗体及肿瘤多肽疫苗的制备创造条件。 实验方法:RT-PCR从A375细胞和K562细胞中分别扩增得到MAGE-4和MAGE-12的全长cDNA,利用半定量RT-PCR检测了MAGE-4、MAGE-12和NY-ESO-1在肿瘤细胞系和食管癌及肺癌组织中mRNA水平的表达。,纯化的蛋白经Western Blot检测和BCA定量。用BIMAS和SYFPEITHE软件进行抗原肽的理论预测和分析。 实验结果:1、RT-PCR获得MAGE-4和MAGE-12的全长cDNA分别为1022bp和1322bp。2、MAGE-4在卵巢癌细胞OVCAR3中不表达,食管癌中表达达60%(18/30),肺癌中表达达30%(8/28)。MAGE-12在卵巢癌细胞系OC3、OVCAR3中不表达,食管癌中表达达70%(21/30),肺癌中表达达36%(10/28)。3、成功构建原核表达载体pGEX-4T-2一MAGE-4,0.1mMIPTG30℃条件下诱导3小时为理想的诱导的条件,SDS-PAGE电泳和Western blot结果证明所获蛋白为目的蛋白。 实验结论:1、原核表达载体pGEX-4T-2-MAGE-4可以高效表达。2、MAGE-4和MAGE-12可用于多表位肿瘤多肽疫苗的制备