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背景黑色素瘤在欧美地区发病率较高,死亡率为39%。恶性黑色素瘤转移是引起患者死亡比例增高的主要原因。而黑色素瘤的转移主要是通过淋巴管进入局部淋巴结。在临床治疗中,清扫前哨淋巴结是预防黑色素瘤转移的可行的方法。但是,与黑色素瘤淋巴转移有关的潜在机制仍不十分清楚。Claudins是一类膜紧密连接蛋白(tight junctions,TJs),可调节细胞的生长和粘附,维持细胞旁路的通透性以及上皮细胞的极性。在肿瘤转移中TJs引起的上皮细胞和内皮细胞膜的完整性丧失,影响肿瘤细胞的迁移和扩散,研究表明Claudin-1蛋白的缺失促进黑色素瘤的脑转移。Claudin-3在人的多种癌症中表达,而在不同肿瘤中Claudin-3与肿瘤的分期与转移呈现不同的相关性。例如,Claudin-3在肺腺癌中被上调而在肺鳞状细胞癌中被下调。Claudin-3的缺失可通过促进肿瘤细胞的存活和侵袭而提高肺鳞癌的转移。此外,Claudin-3蛋白在结肠癌,胰腺癌,前列腺癌,胃癌和乳腺癌中的表达水平已被证实与肿瘤分期呈正相关。然而,Claudin-3与黑色素瘤转移之间的关系并不清楚。我们利用Claudin-3基因敲除小鼠建立了 B16F10足垫荷瘤动物模型,研究结果发现Claudin-3的缺失促进了黑色素瘤B16F10细胞转移到引流淋巴结,同时Claudin-3敲除小鼠肿瘤中淋巴管的数量明显增多。本结果表明Claudin-3的缺失促进黑色素瘤的转移,为黑素瘤转移的临床治疗提供新的思路和可能的分子靶标。目的本课题旨在研究在肿瘤微环境中Claudin-3蛋白缺失对黑色素瘤淋巴结转移的影响。方法1.为了确定Claudin-3-/-小鼠(KO)是否为纯合型敲除鼠,使用核酸凝胶电泳技术进行基因鉴定。2.取野生型对照组Claudin-3+/+小鼠和Claudin-3-/-小鼠构建足垫荷瘤动物模型,首先注射带m-Cherry荧光标签的B16F10黑色素瘤细胞于野生型对照组Claudin-3+/+小鼠和Claudin-3-/-小鼠足部进行荷瘤。观察足部荷瘤鼠的生存期、体重和肿瘤大小的变化情况。3.野生型对照组Claudin-3+/+小鼠和Claudin-3-/-小鼠足部荷瘤的25天后,处死小鼠,取出足部荷瘤同侧膝后窝淋巴结(dpLN)、同侧腹股沟淋巴结(diLN)、对侧膝后窝淋巴结(pLN)及原位肿瘤,观察肿瘤转移的情况。4.同时对荷瘤小鼠的淋巴结进行流式分析,定量分析转移至淋巴结的带有m-Cherry荧光标签的B16F10黑色素瘤细胞数量。5.原位瘤磨碎,通过免疫荧光染色技术、流式细胞分析技术检测肿瘤中免疫细胞的浸润情况,使用PCR技术检测分泌因子的变化。6.对取下的原位肿瘤进行冰冻切片,然后进行免疫荧光染色,观察肿瘤内淋巴管和血管的数量和结构的变化。7.为了分析黑色素瘤表达Claudin-3蛋白的情况,对黑色素瘤组织芯片进行免疫组织化学染色。8.RT-PCR技术检测淋巴管内皮细胞SVEC4-10细胞系上Claudin-3蛋白的表达情况9.为了观察在小鼠正常情况下Claudin-3-/-小鼠的新生淋巴管的渗透功能,在野生型对照组Claudin-3+/+小鼠和Claudin-3-/-小鼠足部注射Evans blue染料,观察分析淋巴管的功能。结果1.经鉴定Claudin-3-/-小鼠为纯合型敲除鼠。成功构建黑色素瘤转移动物模型。2.经过足部荷瘤统计观察到Claudin-3--/-小鼠生存期比Claudin-3+/+小鼠的生存期短,Claudin-3-/-小鼠的体重、肿瘤体积和肿瘤重量与Claudin-3+/+小鼠并无明显差异。3.Claudin-3-/-小鼠足部荷瘤的同侧膝后窝淋巴结和同侧腹股沟淋巴结的黑色素瘤细胞转移量比Claudin-3+/+小鼠多,Claudin-3-/-小鼠和Claudin-3+/+小鼠对侧膝后窝淋巴结的黑色素瘤细胞转移量并无差异。4.经过对原位瘤的LYVE-1和CD31免疫荧光染色发现Claudin-3-/-小鼠原位瘤内的淋巴管多于Claudin-3+/+小鼠,Claudin-3-/-小鼠和Claudin-3+/+小鼠原位瘤内的血管并无差异。5.黑色素瘤组织和淋巴管内皮细胞上表达Claudin-3蛋白。6.经过流式细胞分析和RT-PCR检测后,发现Claudin-3-/-小鼠的原位瘤内的巨噬细胞和VEGF-C的表达量多于对照组Claudin-3+/+小鼠;两组小鼠原位瘤中的B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例并无差异。7.Claudin-3-/-小鼠的淋巴管渗透功能强于对照组Claudin-3+/+小鼠。结论这项研究表明,Claudin-3缺失促进了足垫荷瘤模型中B16F10黑色素瘤细胞的淋巴结转移。而Claudin-3-/-小鼠的肿瘤中淋巴管数量,明显多于对照野生型小鼠。进一步的研究发现,Claudin-3-/-小鼠的原发肿瘤部位存在大量的促淋巴管生成因子VEGF-C。因此,我们的研究结果发现Claudin-3缺失促使黑色素瘤转移。Claudin-3可能作为改善肿瘤进展和转移的潜在靶标。