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乳腺癌是全世界女性肿瘤中最常见的类型,乳腺癌的防治研究十分重要。常见黄酮类化合物抗肿瘤活性的药效学筛选实验中发现3,6-二羟黄酮(3,6-dihydroxyflavone,3,6-DHF)有较强的抗肿瘤活性,能抑制乳腺癌发生。进一步研究发现3,6-DHF在发挥抗乳腺癌发生效应的同时改变了乳腺组织mi RNA的表达谱,其中以miR-34a和mi R-21的变化最为显著,3,6-DHF可能具有调控mi R-34a和miR-21的作用。越来越多的证据表明食物中的营养成分或植物化学物可以调节特定转录位点的表遗传变异,这些营养成分或植物化学物可通过DNA甲基化和组蛋白修饰调控某些特定基因表达,进而抑制肿瘤的发生和发展。miR-34a表达在肿瘤发生过程中可因其基因启动子区DNA甲基化升高而沉默其表达,miR-21的表达水平也受组蛋白乙酰化修饰的调节。基于以上分析,我们提出:3,6-DHF可通过表遗传修饰调控乳腺癌发生过程中mi R-34a和miR-21的表达,抑制乳腺癌的发生。mi R-34a和miR-21对PI3K/Akt/m TOR信号通路有重要的调节作用,10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10,PTEN)是PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制剂,而Notch-1是该信号通路的激活剂,PTEN和Notch-1分别是mi R-34a和miR-21的作用靶点,3,6-DHF可能通过mi R-34a和mi R-21调节PI3K/Akt/mTOR信号通路。因此,本研究从表遗传角度出发,探讨3,6-DHF通过表遗传修饰调控mi R-34a和mi R-21表达的可能机制,并阐明3,6-DHF通过调控mi R-34a和mi R-21抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路,进而抑制乳腺癌发生的机制。本课题采用甲基亚硝基脲(1-methyl-1-nitrosourea,MNU)诱导大鼠乳腺癌发生模型,取实验0、2、18w大鼠乳腺和肿瘤组织分析p-Akt和人甲基胞嘧啶双加氧酶1(The ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase,TET)的表达;采用生长因子依赖性降低(reduced dependence on growth factors,RDGF)、锚定非依赖性生长特性(anchorage independent growth,AIG)和细胞划痕实验评价致癌物4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone,nnk)和苯并芘(benzo[a]pyrene,b[a]p)诱导乳腺上皮细胞mcf10a癌性转化特性;其次,采用甲基化特异性pcr(methylation-specificpcr,msp)、染色体免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)、实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr,qrt-pcr)和sirna转染等方法明确3,6-dhf是否具有调节乳腺癌(breastcancer,bc)细胞mir-34a和mir-21基因表遗传修饰的作用,利用质粒转染、dna斑点印迹和蛋白免疫印迹(westernblot,wb)等技术,分析dna甲基转移酶(dnamethyltransferase-1,dnmt)1和tet1的甲基化调节机制在3,6-dhf调控mir-34a表达中的作用;采用wb和转染等技术进一步明确3,6-dhf通过调控mir-34a和mir-21抑制pi3k/akt/mtor信号通路及下游蛋白s6蛋白激酶(ribosomalp70-s6kinase,s6k70)、核糖体蛋白s6(ribosomalproteins6,rps6)、真核翻译起始因子4b(eukaryotictranslationinitiationfactors,eif4b)和真核生物启动因子4e结合蛋白(4ebindingproteinl,4ebp)1的表达,进而抑制乳腺癌发生的作用。实验结果:(1)mnu诱导大鼠乳腺癌发生过程中取0、2、18w实验大鼠乳腺和肿瘤组织,免疫组化染色表明3,6-dhf能抑制大鼠乳腺和肿瘤组织p-akt的表达,提高tet1的表达水平。致癌物nnk和b[a]p处理乳腺上皮细胞mcf10a(carcinogens-treatedcell,cart)30d,cart细胞表现出显著的rdgf和aig癌细胞特性;与30-dcart细胞相比,3,6-dhf与致癌物联合作用(c-dhf)能显著降低细胞rdgf和aig能力;细胞划痕实验也显示,30-dcart细胞迁移和增殖能力显著增强,c-dhf细胞迁移和增殖能力明显降低。qrt-pcr检测结果显示cart细胞mir-34a表达水平显著下降,mir-21表达水平显著升高,3,6-dhf共同作用可显著抑制致癌剂诱导的mir-34a下调和mir-21上调。此外,3,6-dhf作用乳腺癌(breastcancer,bc)细胞株,能显著上调mda-mb-231(m231)、mcf-7(m7)和mda-mb-453(m453)细胞mir-34a的水平,下调其mir-21水平,anti-mir-34a寡核苷酸或pcdna6.2-gw/mir-21质粒转染能抑制3,6-dhf对m231细胞mir-34a和mir-21的调节。(2)msp检测致癌物作用mcf10a细胞和bc细胞mir-34a基因启动子区dna甲基化。结果显示,30-dc-dhf细胞mir-34a基因启动子区dna甲基化显著降低;同样,3,6-dhf可明显降低bc细胞mir-34a基因启动子区dna甲基化;chip-qpcr检测m231细胞mir-21基因启动子区组蛋白修饰h3k9-14ac、h3k27ac(转录激活的组蛋白修饰)和h3k27me3(转录抑制的组蛋白修饰)水平,结果显示3,6-dhf显著降低h3k9-14ac修饰水平。(3)wb结果显示cart细胞tet1蛋白表达降低,c-dhf细胞tet1蛋白表达高于cart细胞,免疫组化染色显示在mnu诱导的大鼠乳腺癌发生过程中给予3,6-dhf(20mg/kg,i.g.)能提高大鼠乳腺和肿瘤组织tet1蛋白表达;qrt-pcr、wb和dna斑点杂交检测m231细胞tet1和dna甲基化中间产物5羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosion,5hmc)的表达,结果显示3,6-dhf可显著提高细胞tet1和5hmc的表达水平,免疫组化染色显示3,6-dhf能提高m231细胞裸鼠移殖瘤组织tet1和5hmc的表达;msp检测结果显示3,6-dhf能降低m231细胞tet1基因启动子区dna甲基化。(4)dnmt活性检测结果显示3,6-dhf能有效抑制bc细胞dnmt1的活性,利用autodock-vina软件模拟3,6-dhf和dnmt1蛋白的相互作用,结果显示3,6-dhf与dnmt1天然疏水活性结构域最低的结合能为-7.1kcal/mol;采用pcdna3/myc-dnmt1质粒转染m231细胞,wb结果显示dnmt1蛋白表达明显增高,tet1蛋白表达明显下降,3,6-dhf不能提高dnmt1过表达m231细胞内tet1的蛋白表达;msp结果显示,3,6-dhf不能降低dnmt1过表达细胞内tet1基因启动子区dna甲基化。采用tet1sirna转染m231细胞沉默tet1蛋白表达,3,6-dhf不能提高转染后细胞tet1的蛋白表达;qrt-pcr结果显示,3,6-dhf不能提高转染后细胞mir-34amrna水平;msp结果显示,3,6-dhf不能降低转染后细胞mir-34a基因启动子区dna甲基化。(5)对pi3k/akt/mtor信号通路的研究显示,随着致癌物作用时间的延长,cart细胞pi3k(p85、p110)、p-akt(thr308、ser473)和p-mtor(s2448、s2481)蛋白表达逐渐升高,而c-dhf细胞pi3k、p-akt和p-mtor蛋白表达低于cart细胞;akt和mtor激酶活性检测结果显示,与mcf10a细胞相比,cart细胞akt和mtor的活性升高,而c-dhf细胞akt和mtor的活性低于cart细胞;免疫组化染色显示3,6-dhf(20mg/kg,i.g.)干预的mnu诱导大鼠乳腺和肿瘤组织p-akt表达低于没有干预的大鼠。同样,3,6-dhf降低bc细胞pi3k/akt/mtor信号通路pi3k、p-akt和p-mtor的蛋白表达,降低细胞akt和mtor的活性;免疫组化染色显示祼鼠3,6-dhf(20mg/kg,i.g.)干预能显著降低m231细胞祼鼠移殖瘤组织p-akt(t308)的表达;wb检测pi3k/akt/mtor信号通路下游蛋白的表达,结果显示3,6-dhf能显著降低该通路下游s6k70、rps6、eif4b和4ebp1的蛋白表达水平。(6)WB结果显示,随着致癌物作用时间的延长,Car T细胞PTEN蛋白表达水平逐渐降低,Notch-1和Hes-1的蛋白表达水平升高,而C-DHF细胞PTEN蛋白表达水平高于Car T细胞,Notch-1和Hes-1的蛋白表达水平低于Car T细胞。3,6-DHF作用BC细胞能提高PTEN蛋白表达,降低Notch-1和Hes-1蛋白表达。M231细胞转染mi R-21质粒(TCmiR-21)或转染mi R-34a寡核苷酸(TCanti-34a),WB检测结果显示3,6-DHF不能提高TCmi R-21细胞PTEN蛋白表达水平和降低TCanti-34a细胞Notch-1蛋白表达水平,3,6-DHF对TCmi R-21和TCanti-34a细胞Akt和mTOR的活性没有抑制作用。实验结论:(1)3,6-DHF能抑制大鼠乳腺癌发生,抑制致癌物诱导MCF10A细胞发生癌性转化,并能抑制MCF10A细胞癌性转化过程中mi R-34a水平的降低和mi R-21水平的升高。3,6-DHF作用乳腺癌细胞能升高mi R-34a的水平和降低mi R-21的水平;(2)MSP和ChIP-q PCR分析结果提示3,6-DHF通过DNA甲基化调节mi R-34a水平,通过组蛋白乙酰化调节mi R-21的水平;进一步研究表明3,6-DHF通过抑制DNMT1的活性,促进TET1表达,进而调节miR-34a基因启动子区DNA甲基化,促进miR-34a基因转录。(3)利用质粒或寡核苷酸转染,明确3,6-DHF通过mi R-34a和mi R-21调节PTEN、Notch-1蛋白表达,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活性和下游蛋白表达,进而发挥抑制乳腺癌发生的作用。