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冬凌草甲素是冬凌草的主要成分,本论文主要从线粒体通路研究冬凌草甲素诱导人胃癌SGC-7901细胞调亡的机制。本实验采用MTT法检测冬凌草甲素对SGC-7901细胞的细胞毒作用;以倒置显微镜和荧光显微镜观察冬凌草甲素作用于SGC-7901细胞后的形态学变化;用PI单染流式细胞仪(FCM)检测冬凌草甲素作用于SGC-7901细胞后的细胞凋亡率;Fluo-3/AM单染激光共聚焦显微镜(CLSM)检测冬凌草甲素作用于SGC-7901细胞后细胞中Ca2+浓度的变化;JC-1单染激光共聚焦显微镜(CLSM)检测冬凌草甲素作用于SGC-7901细胞后细胞线粒体膜电位的变化;流式细胞仪(FCM)检测冬凌草甲素作用于SGC-7901细胞后Cytochrome C浓度的变化;Caspase-3活性检测试剂盒检测冬凌草甲素对SGC-7901细胞Caspase-3活性的影响。研究表明,冬凌草甲素可抑制人胃癌SGC-7901细胞的生长。半数抑制浓度IC50为22.74 μmol/L。在冬凌草甲素诱导SGC-7901细胞凋亡的实验中分别考察了不同时间和不同剂量对凋亡的影响。冬凌草甲素作用人胃癌SGC-7901细胞24h后,倒置显微镜下观察阴性对照组细胞贴壁生长,细胞膜完整。阳性对照组18 μmol/L羟基喜树碱给药后细胞表面起皱大部分细胞破碎,细胞形态不完整。冬凌草甲素各组随给药浓度增加细胞生长密度逐渐变疏,表面起皱,高浓度(22 μmol/L)组大部分细胞破碎,细胞形态不完整,贴壁细胞数量减少;AO染色荧光显微镜观察SGC-7901细胞形态,阴性组细胞圆润,完好,没有破裂,起皱。给冬凌草甲素各组随给药浓度增加细胞生长密度逐渐变疏,表面起皱,高浓度组大部分细胞破碎,细胞形态不完整。活细胞核呈黄绿色荧光,凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出。流式细胞术分析SGC-7901细胞凋亡率,随着时间的延长和剂量升高,细胞凋亡率逐渐增多。从以上三方面结果得出以下结论:冬凌草甲素可诱导SGC-7901细胞凋亡。在作用机制方面,不同剂量(1.25、2.5、5μmol/L)冬凌草甲素作用SGC-7901细胞24h后,激光共聚焦扫描显微镜检测发现SGC-7901细胞内钙离子升高,并且呈一定的剂量依赖性;对SGC-7901细胞内线粒体膜电位的研究发现,冬凌草甲素能降低细胞的线粒体膜电位并且呈一定的剂量依赖性;对SGC-7901细胞内Cytochrome C的研究发现,冬凌草甲素能升高细胞的Cytochrome C浓度;Caspase-3试剂盒检测细胞内Caspase-3酶发现,冬凌草甲素能显著增加SGC-7901细胞Caspase-3酶活性。所以冬凌草甲素可以升高SGC-7901细胞内Ca2+的浓度;Ca2+浓度的改变可触发线粒体通透孔开放,使线粒体膜电位降低,线粒体通透性改变,诱导线粒体释放细胞色素C并通过一系列反应升高Caspase-3活性。通过实验,本课题得出以下结论:冬凌草甲素可抑制人胃癌SGC-7901的增殖,并可通过线粒体途径诱导SGC-7901细胞凋亡。