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F-box蛋白作为SCF复合体中泛素-蛋白连接酶E3的关键组份,在植物生长发育、激素信号传导、花器官发育和自交不亲和反应中发挥重要的调节作用。近年来,越来越多的研究表明F-box蛋白介导的泛素降解途径也应对非生物及生物胁迫的响应过程。本研究通过对F-box/LRR类基因进行克隆、基因诱导表达分析、诱饵载体构建以及酵母双杂交文库筛选等方法,对Ta-SKP2A基因进行了系统研究。主要研究结果如下: 1、利用生物信息学软件对数据库中小麦F-box基因进行了分析、整理、归类。DFCI和NCBI数据库中共检索到符合条件的F-box基因38条,根据F-box蛋白C端结构域的不同,将其划分为三类:F-box/LRR(17条,占总数的45%)、F-box/Kelch(6条,占总数的16%)和C端无明显结构域(15条,占总数的39%)。 2、克隆了两条小麦F-box基因Ta-SKP2A和Ta-FB。Ta-SKP2A基因包含完整的ORF区,编码382个氨基酸,预测的多肽分子量为40.87kDa,属于F-box/LRR类型;Ta-FB序列较短,未包含完整的ORF区,为C末端无明显结构域的F-box蛋白。 3、组织表达模式结果表明:Ta-SKP2A在中国春小麦雌蕊中高表达,为幼叶表达量的7.5倍;在TcLr15小麦旗叶中的表达量高,为幼叶中表达量的6.5倍;在TcLr38的各个组织中的表达量均较低。在受叶锈菌侵染后,不同抗/感组合中Ta-SKP2A基因呈现不同的表达模式,TcLr15与叶锈菌株05-5-137③形成的感病组合中,Ta-SKP2A的相对表达量最高,CS与05-5-137③形成的感病组合中总体表达量最低。黑暗保湿对该基因的表达影响不大。TcLr15中Ta-SKP2A基因主要受ABA的诱导,反应较迟(12h),总体上受IAA、ABA、MeJA三种激素的影响较小。CS中Ta-SKP2A基因受这三种激素的影响较大,尤其是ABA和MeJA,且反应出现较早。 4、成功构建了中国春小麦的酵母双杂交文库和包含Ta-SKP2A基因的诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A。文库的滴度为9.9×108cfu/mL。文库插入片段大小为250bp~2500bp。诱饵质粒对酵母菌生长无毒害作用和自激活活性。 5、筛选出与Ta-SKP2A有相互作用的候选蛋白8个,分别为小麦蛋白激酶、信号锚、铁蛋白、AZM、SKP1/ASK1、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、Kunitz-type蛋白酶抑制剂、磷酸核酮糖激酶PRK。经X-α-Gal染色验证,表明Rubisco和SKP1/ASK1可能为阳性克隆。经一对一回复验证试验,初步验证了SKP1/ASK1与Ta-SKP2A具有相互作用。 本研究明确了小麦中F-box/LRR类基因Ta-SKP2A的相关特性,并筛选到与其互作的靶蛋白。研究结果既加深了人们对小麦中F-box家族基因的认识,又为揭示该基因在小麦中的功能奠定了基础。