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食管癌是全球癌症发病率排名第7、死亡率排名第6的恶性消化道肿瘤,我国食管癌的年发病率和死亡率约占世界一半以上,其中90%以上的组织学类型为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）。ESCC具有高侵袭性和转移性,10-30%的早期食管鳞癌（粘膜癌和粘膜下癌）,可伴有局部淋巴结转移。早期食管鳞癌伴淋巴结转移（lymph node metastasis,LNM）的准确诊断会在很大程度上影响治疗方案的选择,以及患者的总生存期。尽管目前已有多种影像学诊断方法,如内镜超声、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描和内镜活检等技术提高了对食管癌浸润深度分期和淋巴结转移的检测水平,但对于淋巴结转移检测的准确性并不十分令人满意。因此,进一步发现和验证有效的、无创性的早期ESCC淋巴结转移相关的血清生物标志物有助于早期诊断和有效治疗,从而进一步改善食管癌患者的预后。本实验室前期,采用含19,394个人重组蛋白的高通量蛋白质组芯片（HuProtTM）全面检测了早期食管鳞癌无淋巴结转移患者（ESCC-nLNM）和早期食管鳞癌伴有淋巴结转移（ESCC-LNM）患者,以及健康对照（healthy control,HC）个体的血清自身抗体谱[1]。与HC和ESCC-nLNM组相比,在ESCC-LNM患者血清中发现特异性高表达的28种IgG型和9种IgM型候选自身抗体,其中BTB和CNC同源体1（BTB and CNC homology 1,BACH1）自身抗体是ESCC-LNM组中显著升高的IgG型自身抗体之一。本课题扩大样本量在独立的ESCC验证队列中,利用半定量免疫印迹分析方法进行验证。结果显示与HC组相比,Anti-BACH1 IgG抗体在ESCC患者血清中显著升（P<0.01）;在食管鳞癌中,与ESCC-nLNM组相比,ESCC-LNM组患者血清中Anti-BACH1 IgG抗体水平显著升高（P<0.01）。利用受试者工作曲线（receiver operating characteristic,ROC）分析评价Anti-BACH1 IgG抗体作为ESCC淋巴结转移候选标志物的灵敏度为23.1%,特异性为92%,曲线下面积（area under the curve,AUC）为0.672。Anti-BACH1 IgG阳性率与ESCC淋巴结转移（P=0.0145）及AJCC分期（P=0.0012）显著相关,与性别、组织学分级、远处器官转移等临床特征无相关性。以上研究结果表明Anti-BACH1 IgG为ESCC伴有淋巴结转移的潜在标志物。多数肿瘤相关自身抗体的产生是由于恶性肿瘤中肿瘤相关性抗原（tumor associated antigen,TAA）的异常表达导致免疫耐受丧失引起的。我们利用免疫组织化学染色（immunohistochemistry,IHC）检测发现BACH1蛋白在ESCC组织中的表达相对癌旁组织显著升高（P<0.01）。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库ESCC RNA-seq数据集分析结果也发现BACH1的mRNA表达水平在ESCC组织中显著升高（P=0.0344）,而且高表达BACH1与食管鳞癌患者缩短的整体生存期（overall survival,OS;P=0.0385）和无病生存期（disease free survival,DFS,P=0.0112）相关。因此,BACH1可能是ESCC进展和转移的一个潜在促癌基因。进一步,我们通过体外和体内功能研究探索了 BACH1促进ESCC进展的分子机制。BACH1基因干扰敲降后,食管鳞癌KYSE30和KYSE170细胞的侵袭转移能力减弱,裸鼠皮下移植瘤生长减缓。相反,在食管鳞癌KYSE150细胞中过表达BACH1可以显著提高ESCC细胞的侵袭迁移能力,促进裸鼠皮下移植瘤的生长。BACH1基因敲降后显著降低食管鳞癌细胞中N-Cad、Slug和Vimentin分子的表达;过表达BACH1后上调了N-Cad、Slug和Vimentin分子的表达。通过ChIP-qPCR实验,在食管鳞癌细胞中验证了转录因子BACH1可以直接与CDH2、SNAI2和VIM基因的转录调节区结合,调控这些基因的转录和表达。双荧光素酶报告实验进一步证实,BACH1过表达显著增强了CDH2基因转录启动子活性,促进间叶表型标志物N-Cad蛋白的表达。利用免疫组化分析了食管鳞癌组织中BACH 1与N-Cad、Slug、Vimentin蛋白表达的相关性,结果表明BACH1表达升高与N-Cad（P=0.0051）、Slug（P=0.0106）和Vimentin（P=0.0431）升高有显著相关性。因此,BACH1 增强ESCC细胞的侵袭转移能力可能是通过激活上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）引起的。此外,在BACH1 敲降的食管鳞癌细胞中,VEGFC mRNA表达显著降低,BACH1可以结合到VEGFC转录调节区调节其表达。通过分析GEO数据库和TCGA数据库也证实了 VEGFC mRNA在食管鳞癌组织中表达显著升高（P=0.0035）,BACH1与VEGFC mRNA表达呈正相关（P=0.012）。同样,在裸鼠皮下移植瘤组织中发现BACH1基因敲除后N-Cad、Slug、Vimentin、CD31+血管密度和VEGFC表达显著低于对照组,BACH1敲降后可能通过抑制血管生成和EMT抑制了食管鳞癌的体内增殖。综上所述,本研究发现Anti-BACH1 IgG自身抗体可能是早期食管鳞癌淋巴结转移的潜在标志物,食管鳞癌组织中BACH 1高表达预示了 ESCC患者预后不良。BACH1通过诱导EMT和血管生成,加速了食管鳞癌增殖和侵袭转移。本研究结果丰富了BACH1在食管鳞癌中的生物学功能,为探索食管鳞癌的生物标志物提供了新的靶点。