脑血管性疾病是临床上的常见病，其特点是残疾率高，死亡率高，其中缺血性脑卒中占80％左右。在临床上，应尽快恢复患者缺血区域的血流供应，以免进一步造成脑组织缺血的不可逆损伤。然而，它也可能诱发更严重的后果（脑功能障碍），称其为脑缺血/再灌注（I/R）损伤。脑缺血/再灌注损伤的病理生理发病机制极其复杂，涉及多种病理联系，包括能量代谢紊乱，局部酸中毒，炎症反应，自由基损伤，诱导细胞凋亡和自噬。这些病理学联系并不是独立存在的，相反，它们是相互交织的，会引发一系列级联反应。脑缺血再灌注过程中会产生大量的氧自由基（氧化剂），并且氧化应激在中风后脑损伤中起重要作用。除了氧化大分子导致细胞损伤外，氧化剂也参与细胞死亡/生存信号通路，并导致线粒体功能障碍。动物实验研究表明，超氧化物歧化酶（氧化蛋白）过表达或缺乏（基因敲除），为缺血性脑损伤氧化应激作用提供了强有力的证据。最近的报道证实，除线粒体外，NADPH氧化酶（NOX）也参与了大脑中风后氧化剂的产生有关。抑制NOX表达对脑缺血损伤具有神经保护作用。因此，超氧化物歧化酶（SOD）和NOX在大脑中的活性是脑缺血性损伤、修复的重要决定因素，而这些主要的抗氧化剂和促氧化剂酶是脑卒中治疗的潜在内源性分子靶标。目前，临床上缺乏相应治疗脑缺血/再灌注损伤时有效清除自由基的药物。因此，在目前的脑神经疾病领域寻找治疗脑缺血/再灌注损伤的有效且低毒的新型抗自由基药物是当前研究的焦点之一，积极探寻治疗缺血性脑卒中的新型药物及其作用机制的研究具有重要的意义。最近研究表明，中草药中的大量有效成分可以达到治疗脑缺血/再灌注损伤的满意效果，为临床新药的开发提供了明确的方向。
　　二苯乙烯苷（Tetrahydroxy Stilbene Glucoside，TSG）是传统草药何首乌中的主要活性成分，已有的研究证实TSG具有广泛的药理学活性，包括抗氧化，抗炎，降低血脂，神经保护和抗肿瘤等药理作用。有趣的是，在APP695V717I转基因小鼠（阿尔茨海默氏病的转基因动物模型，AD）模型中TSG可以抑制小鼠海马组织中Beclin-1和LC3-II的表达，从而改善小鼠的学习记忆和空间定向行为。因此， TSG具有抗衰老和神经保护作用，其作用机理可能是多靶点，多环节，多途径的，其对于老年性痴呆等神经退行性疾病的防治具有很好的作用。然而，现有文献在TSG对脑缺血/再灌注（I/R）损伤的潜在保护作用以及相关的神经保护作用机制报道较少。
　　本文采用大脑中动脉闭塞（MCAO）制备小鼠脑缺血再灌注（I/R）模型和H2O2诱导小鼠海马神经元HT22细胞氧化应激损伤模型，全面评价与考察TSG通过抑制氧化应激反应对I/R小鼠脑损伤及H2O2诱导海马神经元细胞损伤的保护作用，力求阐明TSG对I/R小鼠脑损伤的神经保护作用机制。
　　第一部分 二苯乙烯苷抑制NAPDH氧化应激减轻小鼠脑缺血/再灌注损伤引起的凋亡与自噬作用机制
　　目的：二苯乙烯苷（TSG）是从我国广泛使用的传统中药何首乌中提取的有效单体成分，近年来研究发现其对脑缺血再灌注损伤有显著的保护作用，但对其潜在的保护作用机理仍不清晰。本部分研究我们将重点探讨TSG通过抑制氧化应激对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及潜在神经保护作用机制。
　　方法：线栓法制备 KM种小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤（MCAO）模型，小鼠完成脑缺血2 h，然后再灌注22 h，造模结束后对各组小鼠进行神经功能学评分；评分结束后处死小鼠，取脑行大脑组织TTC染色并计算每只小鼠脑梗死体积百分比（%）；HE染色观察各组小鼠缺血侧大脑皮层和海马组织CA1区神经元病理学变化；Western blotting分别检测各组小鼠缺血侧大脑皮层和海马组织中 NOX4，Caspase-3，Caspase-9，Beclin1和LC3BⅡ/Ⅰ的表达。ESR波谱仪检测缺血脑组织氧自由基信号，试剂盒检测小鼠缺血侧脑组织中SOD的活性和MDA的水平。
　　结果：与Sham组相比，I/R组小鼠神经功能学评分增加显著（P<0.01），缺血侧脑组织TTC染色呈明显的苍白色梗死灶，其脑梗死体积百分比显著增加（P<0.01）。与I/R组小鼠相比，TSG高、中、低剂量处理组可显著降低小鼠神经功能学评分，并减少小鼠脑梗死体积百分比（P<0.05或P<0.01），改善小鼠脑缺血再灌注损伤；另外，病理组织学检测显示TSG可显著改善小鼠脑缺血侧皮层和海马神经元的损伤，减轻病理性损害。TUNEL染色结果显示，假手术组小鼠脑皮层与海马 CA1区神经元形态呈圆形或椭圆形，细胞间间隙明显，细胞膜与细胞核界限分明；与假手术组相比，I/R组小鼠脑皮层和海马CA1区神经元细胞胞膜与胞质均见有明显的褐色或深棕色凋亡颗粒，神经元细胞凋亡增多；与I/R组相比，TSG高、中剂量组小鼠脑皮层和海马CA1区神经元细胞胞膜与胞质可见少量褐色或深棕色凋亡颗粒，神经元细胞凋亡较I/R组显著减少。与Sham组相比，I/R组小鼠缺血侧脑皮层与海马组织 NOX4蛋白表达显著上调（P<0.01），凋亡蛋白 Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9以及自噬蛋白Beclin1和LC3BⅡ表达增加，LC3BⅡ/Ⅰ比值增大（P<0.05或P<0.01）；与I/R组小鼠比较，TSG给药组可显著抑制小鼠缺血侧皮层和海马组织NOX4的表达，并且抑制凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的激活，并减少自噬蛋白Beclin1和LC3BⅡ的表达，LC3BⅡ/Ⅰ比值减小（P<0.05或P<0.01）。
　　结论：TSG对MCAO小鼠脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用，其机制可能与抑制NAPDH氧化应激减轻MCAO小鼠脑缺血/再灌注损伤引起的凋亡与过度自噬有关。
　　第二部分 二苯乙烯苷促进自噬流减轻H2O2诱导HT22细胞氧化应激损伤中的作用及机制
　　目的：本部分重点探讨二苯乙烯苷（TSG）减轻H2O2诱导HT22细胞氧化应激损伤的保护作用及其抑制氧化应激导致的自噬流受阻，从而减少自噬体累积与凋亡的潜在机制。
　　方法将HT22细胞随机分成三组：正常对照组，H2O2处理组和TSG（10μmol/L）预处理组。通过MTT法检测细胞活力；DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）水平；自噬腺病毒（mRFP-GFP-LC3）感染HT22细胞，评估自噬溶酶体及自噬体数量。采用Western blot法检测NOX4，Beclin1，LC3Ⅱ/Ⅰ，P62和Cleaved Caspase-3， Cleaved Caspase-9蛋白的表达。
　　结果：H2O2诱导HT22细胞氧化应激损伤后，与正常对照组相比，H2O2组HT22细胞NOX4蛋白表达显著上调，ROS水平显著升高；与H2O2组相比，TSG（10μmol/L）处理组可显著抑制HT22细胞NOX4蛋白的表达，降低细胞内ROS水平。通过自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）感染HT22细胞，观察HT22细胞内自噬溶酶体与自噬体的变化。与正常对照组相比，H2O2组细胞内自噬溶酶体数量减少，其自噬流受阻，自噬体增多，导致神经元细胞过度自噬。与H2O2组相比，TSG（10μmol/L）可显著抑制H2O2诱导HT22细胞氧化应激损伤引起的自噬流受阻，减少细胞内自噬体累积，抑制神经元过度自噬。上述研究结果提示H2O2诱导HT22细胞氧化应激过程中可导致自噬流受阻，TSG（10μmol/L）可抑制氧化应激引起的HT22细胞的自噬流受阻，减少自噬小体的累积，抑制氧化应激导致HT22细胞的过度自噬。另外，Western blot结果显示，与正常对照组相比，H2O2组HT22细胞中LC3Ⅱ蛋白表达显著增加，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值增加，自噬蛋白Beclin1上调， P62蛋白表达下调。与H2O2组相比，TSG（10μmol/L）处理组HT22细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达水平较低，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值减小，并可抑制氧化应激引起的HT22细胞Beclin1上调，同时上调P62蛋白表达。相关凋亡检测发现，H2O2组HT22细胞凋亡增多，相关蛋白Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9蛋白表达量显著增加。与H2O2组比较，TSG（10μmol/L）处理组可显著抑制氧化应激导致的HT22细胞的凋亡，并抑制凋亡蛋白Caspase-3，Caspase-9的激活。
　　结论：TSG可显著抑制H2O2诱导的HT22细胞氧化应激损伤，其机制可能与抑制NOX4/ROS途径，下调NOX4蛋白表达，抑制细胞内ROS的产生，从而抑制了氧化应激损伤导致的HT22细胞自噬流受阻，减少细胞内自噬体累积，防止神经元细胞过度自噬，减少HT22细胞凋亡和死亡，对神经元细胞产生保护作用。