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目的所在课题组既往研究证明,甲壳类动物外骨骼及真菌细胞壁等的主要成分几丁质的降解产物壳寡糖(chitosan-oligosaccharides, COS)具有明确的改善血脂并促进胆固醇逆向转运作用,但对动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)斑块形成的影响尚无文献报道。本研究以自发AS的载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout, apoE-/-)小鼠为模型并采用高脂肪高胆固醇饲料诱导AS斑块形成,观察COS对AS损伤的影响,并对其机制进行分析;为进一步验证其机制,检测不同剂量的COS在体外模型对胆固醇代谢相关基因表达的影响。方法1.本实验选用12周龄雄性apoE-/-小鼠35只,随机分为3组:(1)模型组(Model组,n=11),给予灭菌蒸馏水;(2)COS低剂量组(COS-L组,n=12),给予COS剂量为250mg/kg;(3)COS高剂量组(COS-H组,n=12),给予COS剂量为1000mg/kg。每天固定时间灌胃,体积为0.01L/kg,同时给予高脂肪高胆固醇饮食(含15.8%脂肪和1.25%胆固醇)喂养12周,自由饮水,12h亮/12h暗光照循环。2.灌胃第12周末,禁食12小时后,麻醉,内眦静脉取血,分离血浆检测总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol, HDL-C),通过快速蛋白液相色谱(Fast protein liquidchromatography, FPLC)分析血浆脂质谱,蛋白免疫印迹技术(Western Blot)技术检测血浆载脂蛋白B(apolipoprotein B, apoB)含量。3.解剖分离小鼠主动脉,剖开内膜后进行油红O染色,同时主动脉根部连续冰冻切片后也行油红O染色,采集图像并应用Image-Pro Plus6.0software统计主动脉内膜和主动脉根部斑块面积,分别请两位观察者以随机、双盲方式评估动脉粥样硬化损伤程度。4.免疫组化法检测COS处理组与对照组主动脉根部冰冻切片斑块部位的巨噬细胞含量和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9, MMP-9)的含量差异。5.酶联免疫吸附试剂盒检测小鼠血浆白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)含量。6.实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)技术和Western Blot技术检测肝脏和腹腔巨噬细胞与胆固醇代谢相关基因的表达:三磷酸腺苷结合盒式转运子A1和G1(ATP-binding cassette transporters A1and G1, ABCA1and ABCG1)、低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDL-R)、清道夫受体BI(scavenger receptor BI,SR-BI)等。7.为进一步明确COS对胆固醇代谢相关基因的作用,采用不同浓度的COS干预肝细胞模型HepG2细胞和巨噬细胞模型RAW264.7细胞,检测上述与胆固醇代谢相关的基因mRNA表达。结果1.COS明显改善血浆脂蛋白的脂质和蛋白表型:COS-L组和COS-H组TC分别比Model组低11%(P<0.05)和23%(P<0.01);血浆TG显著改善,COS-L和COS-H分别比Model组低29%(P<0.05)和31%(P<0.01),而HDL-C的差别无统计学意义(P>0.05);在COS组,非-HDL颗粒上的胆固醇(Non-HDL-C)和TG明显低于Model组;COS-H组血浆载脂蛋白B100(apolipoprotein B, apoB100)比Model组低56%(P<0.05)。2.COS可剂量依赖地减轻AS:主动脉内膜损伤面积统计表明,COS-L组和COS-H组分别较Model组低27.6%(P<0.05)和33.3%(P<0.01);主动脉根部斑块面积统计表明,COS-L组和COS-H组分别较Model组低30.4%(P<0.05)和54.3%(P<0.01)。3.COS可减少主动脉根部斑块内巨噬细胞含量,与Model组相比,COS-L组主动脉根部斑块内巨噬细胞含量低32%(P<0.01),COS-H组低55%(P<0.01);COS各组斑块部位MMP-9含量与Model组差异无统计学意义(P>0.05)。4.COS处理组血浆IL-6、TNF-α水平较Model组差异无统计学意义(P>0.05)。5.COS可促进apoE-/-小鼠肝脏LDL-R和SR-BI的mRNA和蛋白表达;COS可明显促进apoE-/-小鼠外周巨噬细胞ABCA1和SR-BI的mRNA和蛋白表达。6.COS可增加HepG2细胞SR-BI、LDL-R mRNA水平的表达以及RAW264.7细胞ABCA1mRNA水平的表达。结论1.COS能减轻高脂饲料诱导的apoE-/-小鼠AS损伤;2. COS减轻apoE-/-小鼠AS损伤的可能机制有:(1)COS降低apoE-/-小鼠血浆Non-HDL的胆固醇和TG;(2)COS减少AS斑块内巨噬细胞含量;(3)COS在体和离体条件下均能增加肝细胞LDL-R和SR-BI的表达;(4)COS在体和离体条件下均能增加巨噬细胞ABCA1表达。