天然药物是指植物、动物、微生物和矿物质等自然界中天然存在的具有药理活性的天然产物。我国天然药物资源蕴藏丰富,自古以来就有“神农尝百草,始有医药”的传说,由此可见,对于这些宝贵资源的开发与有效利用可追溯到距今7000年前的神农时代。天然药物是中国传统医学发展的物质基础,是中华民族文化瑰宝之一。然而,对于大部分民间常用药材,其化学成分及药理活性缺乏系统的科学研究,这严重影响了我国天然药物的进一步开发以及应用。本课题以中国传统药材假升麻为研究对象,运用科学方法对其化学成分及药理活性进行了系统研究,为假升麻的临床应用和后续开发提供科学依据和理论指导。假升麻(Aruncus sylvester Kostel.)隶属蔷薇科(Rosaceae)绣线菊亚科(Spiraeoideae Agardh)假升麻属(Aruncus Adans.)。本属约有6种,分布于北半球冷温带。中国产2种,分别是假升麻(A.sylvester Kostel.)和贡山假升麻(A.gombalanus Hand.-Mazz.),其中假升麻(A.sylvester Kostel.)是该属的模式种,为多年生草本植物,根茎粗大,基部木质化。花期为六月,果期为八到九月。多生于海拔1800-3500米的山沟、山坡杂木林下,广泛分布于我国北部地区的黑龙江、吉林、辽宁、甘肃、陕西、西藏,也分布于日本、朝鲜和俄罗斯等地。假升麻(A.sylvester Kostel.)的根在中国陕西一带被称作金毛三七,为陕西七药之一,在民间常用于治疗损伤和劳伤筋骨疼,有舒筋活络止疼的功效。目前国内外尚无对假升麻(A.sylvester Kostel.)化学成分及其生物活性的研究报道,据其同属其它植物的文献报道,假升麻属植物中分离得到的化合物主要包括苯丙素、酚酸、黄酮、单萜类化合物。对假升麻属植物的活性研究多集中于A.dioicus var.Kamtschaticus,研究表明该植物的乙醇提取物在抗氧化,降血糖,抗血栓,抗炎,抗菌等方面均有一定效果。本课题对假升麻(A.sylvester Kostel.)干燥根的化学成分及生物活性进行了研究。主要对假升麻根的乙酸乙酯萃取部分和正丁醇萃取部分中极性较大的部分进行了化学成分研究,通过运用硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、葡聚糖凝胶LH-20柱色谱、反相中压柱色谱、高效液相色谱等提取分离技术分离纯化得到了18个化合物,经过紫外色谱、红外色谱、高/低分辨质谱、一维/二维核磁共振波谱等结构鉴定技术鉴定了17个化合物,其中包括8个新的化合物,4个首次从该植物中分到的化合物。通过自由基清除试验和α-葡萄糖苷酶抑制试验对假升麻根的粗提物进行了活性测定,实验结果表明假升麻根的乙酸乙酯萃取部分具有良好的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。对单体化合物的活性测定结果表明,1,3,6-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖和1,3,4-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖具有很强的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。假升麻干燥根采集于陕西省眉县,共计23.3 Kg,适当粉碎后用95%乙醇在室温下充分浸泡。药材冷浸提取一周,之后回收冷浸液。将充分浸泡过的假升麻根用95%乙醇加热回流提取2次,60%乙醇加热回流提取1次,每次两小时。合并提取液,减压浓缩,得到浸膏3.2 Kg。将浸膏混悬于6 L的蒸馏水中,然后依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,从而得到假升麻根的石油醚萃取部分(ASP,88 g)、乙酸乙酯萃取部分(ASE,800 g)和正丁醇萃取部分(ASB,308 g)。之后将正丁醇萃取部分(ASB)通过D101大孔吸附树脂进一步分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇梯度洗脱,得到假升麻根正丁醇萃取部分的水洗脱部分(ASBH,71 g),30%乙醇洗脱部分(ASB 30,87 g),50%乙醇洗脱部分(ASB 50,31 g),70%乙醇洗脱部分(ASB70,5 g)和90%乙醇洗脱部分(ASB 90,1 g)。ASE和ASB 50部分通过薄层色谱、硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、葡聚糖凝胶LH-20柱色谱、反相中压柱色谱、高效液相色谱等提取分离技术分离纯化得到了18个化合物,并综合运用紫外色谱、红外色谱、高/低分辨质谱、一维/二维核磁共振波谱以及圆二色谱等结构鉴定方法,鉴定了17个化合物,其中有8个新化合物,分别为:3,4-二-O-(E)-咖啡酰基-α-D-葡萄吡喃糖(3,4-di-O-(E)-caffeoyl-α-glucopyranoside,ASB 50-9a)、3,4-二-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖(3,4-di-O-(E)-caffeoyl-β-glucopyranoside,ASB 50-9b)、假升麻苷B(sylvesteroside B,ASB 50-6)、假升麻苷D(sylvesteroside D,ASB50-13)、假升麻苷E(sylvesteroside E,ASB 50-2)、假升麻苷F(sylvesteroside F,ASB 50-12)、假升麻苷G(sylvesteroside G,ASB 50-5)、假升麻苷H(sylvesteroside H,ASB 50-10);以及9个已知化合物,分别是:咖啡酸(caffeic acid,ASE-5),咖啡酸甲酯(methyl caffeate,ASE-7),grayanin(ASE-10),aruncide A(ASB 50-1),顺式阿魏酸-1-O-β-D吡喃葡萄糖苷(cis-feruloyl glucose,ASB 50-11a),反式阿魏酸-1-O-β-D吡喃葡萄糖苷(trans-feruloyl glucose,ASB50-11b),2S-圣草酚-7-O-β-D吡喃葡萄糖苷(2S-eriodictyol-7-O-β-D glucopyranoside,ASB 50-8a),2R-圣草酚-7-O-β-D吡喃葡萄糖苷(2R-eriodictyol-7-O-β-D glucopyranoside,ASB 50-8b),异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside,ASB 50-15)。从核磁共振氢谱的变化中可以看出,ASB 50-8(8a和8b)、ASB 50-9(9a和9b)、ASB 50-11(11a和11b)均为同分异构体,这给分离纯化以及结构鉴定带来了一定难度。新化合物中ASB 50-2、ASB 50-12、ASB 50-5和ASB 50-10的平面结构较为类似,均由葡萄糖基、咖啡酰基和一个单萜片段构成,其中咖啡酰基中的碳碳双键在光照下会由反式转换为顺式,并且单萜结构片段中存在多个手性中心,这给绝对构型的确定带来了极大困难。与此同时,由于分离得到的单体化合物质量较少,并且在一定程度上都发生了构型的转换,所以新化合物ASB 50-2、ASB 50-12、ASB 50-5和ASB 50-10的绝对构型未能得到确证。本课题通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法对假升麻根乙醇提取物各萃取部分的抗氧化活性进行了评价。结果表明,与阳性对照品抗坏血酸(IC50,147.0μg/m L)相比,假升麻根乙酸乙酯萃取部分和正丁醇萃取部分均表现了一定程度的抗氧化活性,其中乙酸乙酯萃取部分有较强的抗氧化活性,其IC50值为117.6μg/m L;正丁醇萃取部分抗氧化活性较弱,其IC50值为492.7μg/m L。在此基础上,选取了6个含量较高且结构具有代表性的单体化合物进行进一步的抗氧化活性研究,分别是1,3,6-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、1,3,4-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、3,4-二-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、3,6-二-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、1,4-二-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、1-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖。结果表明,1,3,6-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖和1,3,4-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖具有很好的抗氧化活性,其IC50值分别为135.59μM和111.41μM。本课题采用4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)法对假升麻根乙醇提取物各萃取部分的α-葡萄糖苷酶抑制活性进行了评价。结果表明,假升麻根乙酸乙酯萃取部分和正丁醇萃取部分均表现了良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中乙酸乙酯萃取部分有较强的抑制活性,其IC50值为3.2μg/m L;正丁醇萃取部分抗氧化活性相对较弱,其IC50值为28.0μg/m L,但两部分都显著优于阳性对照品阿卡波糖(IC50,415.0μg/m L)。针对测试过抗氧化活性的6个单体化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选,结果表明,1,3,6-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖(IC50,1.16μM)和1,3,4-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖(IC50,0.71μM)具有很好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。通过DPPH自由基清除试验和α-葡萄糖苷酶抑制试验结果可以看出,假升麻根乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分具有较好的抗氧化活性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性,而ASE部分的主要成分为咖啡酰基类化合物,因此咖啡酰基类化合物可能是假升麻生物活性的主要化学成分。此外,对于1,3,6-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、1,3,4-三-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、3,4-二-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、3,6-二-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、1,4-二-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖、1-O-(E)-咖啡酰基-β-D-葡萄吡喃糖的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究结果表明,对于咖啡酰基葡萄糖苷类化合物,其生物活性与化合物结构中咖啡酰基的数量以及咖啡酰基和糖基的连接位点有一定联系。本课题系统地研究了假升麻根的化学成分和生物活性,并成功筛选出两个具有良好抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,为假升麻在今后的研究发展和临床应用提供了科学依据。