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研究背景人类白细胞抗原系统(HLA)的研究不仅在造血干细胞和器官移植中发挥着重要的作用，而且也给基础免疫学带来了突破性进展。在实际临床工作中，准确的患者及供者的HLA分型，对选择合适的供体，降低移植物抗宿主疾病的发生，以及提高移植物的存活率有着重要的意义。HLA分型主要有血清学分型方法和基因分型方法。由于血清学方法存在较大的误差，随着分子生物学技术的发展和广泛应用，已逐步被基因分型方法所取代。目前，主要的HLA基因分型方法有：PCR-SSP、PCR-SSO、流式细胞术、PCR-SBT、基因芯片等。其中，直接测序分型(sequencing-based typing，SBT)，是目前HLA基因分型方法中最准确，最可靠和最彻底的方法。本实验的目的在于运用DNA序列测定技术、单链特异性引物测序方法和克隆技术，建立一个准确、完整和可靠的HLA-B等位基因SBT分型方法。方法本实验标本来自临床随机样本，质量控制标准品为亚太地区组织配型协会(Australasian and South east ASian tissue typing association，ASEATTA)质控标本、中华骨髓库室间质评标本。常规PCR-SBT方法采用PCR反应扩增HLA-B基因1-8号外显子，对PCR产物纯化后分别用2，3，4外显子引物进行双向测序，用专业软件分析指定测序结果，并通过标准质控标本验证方法的准确性。单链特异性引物测序方法为设计针对HLA-B等位基因的特异性引物，通过引物的选择直接扩增特定的等位基因，有效将杂合序列进行分离而进行测序分析。HLA-B位点克隆转染技术采用TOPO TA连接试剂，获取质粒DNA进行序列测定。实验结果(1)采用本方法获取的质控标本检测结果与预期结果完全一致；(2)通过对随机临床样本分型检测首次得到了浙江人群HLA-B等位基因在高分辨水平的遗传多态性数据，其中HLA-B*4001基因频率为12.9％，B*4601基因频率为8.2％，B*5801基因频率为8.0％。(3)发现了三例新的HLA-B等位基因，被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为B*4061、B*5136、B*5522。结论(1)实验建立的HLA-B等位基因PCR-SBT分型方法准确可靠，可以用于日常HLA-B高分辨分型工作和解决其他基因分型方法中遇到的疑难样本问题。(2)获取了浙江汉族人群HLA-B等位基因在高分辨水平的遗传多态性数据。