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乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称,在食品工业和医疗保健等领域有着广泛的应用。但其自然菌株往往不具备工业生产所需要的各种优良性状或者性状不显著。因此需要使用定向培育、诱变育种和细胞融合等育种方法来选育性状优良的菌株。用于制造酸奶的德氏乳杆菌保加利亚亚种是导致酸奶后酸化的主要诱因,酸奶的后酸化会导致酸奶出现消费者不可接受的过酸味及感官质量下降,影响酸奶的长期贮存,因此利用诱变育种来筛选弱后酸化德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵剂菌株并对其遗传稳定性进行检测对直投式酸奶发酵剂的工业应用具有重要意义。本课题包括以下几个实验：H+-ATPase缺陷突变菌株的诱变、酸应激及冷应激对亲本和突变菌株生长及质膜H+-ATPase活性的影响、突变菌株遗传稳定性实验、H+-ATPase缺陷突变菌株的代谢动力学、亲本和突变菌株H+-ATPase表达的比较、弱后酸化酸奶的研制。首先利用新霉素作为诱变压力,从本实验室选育的一株可用于制作酸奶发酵剂的德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1.9201筛选得到一株H+-ATPase缺陷的自发突变菌株,命名为KLDS1.9201-11。对KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的生长情况和pH值进行测定,发现KLDS1.9201-11的生长速率明显比KLDS1.9201的低,而且在生长过程中其pH值明显高于KLDS1.9201,即产酸能力较弱。使用天根DP430细菌RNA提取试剂盒提取KLDS1.9201和KLDS1.9201-11对数期和稳定期的总RNA,经DNaseI(RNase-free)处理后反转录成cDNA,然后使用实时荧光定量PCR检测来测定KLDS1.9201和KLDS1.9201-11对数期和稳定期中质膜H+-ATPase的表达,结果表明,各菌株的H+-ATPase酶的表达量差异显著(p<0.05),其中,对数期的KLDS1.9201-11(突变菌株)的H+-ATPase酶的表达量约是KLDS1.9201(亲本菌株)的24%,稳定期的KLDS1.9201-11(突变菌株)的H+-ATPase酶的表达量约是KLDS1.9201(亲本菌株)的33%。对KLDS1.9201和KLDS1.9201-11进行酸应激和冷应激,在酸应激后,KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的存活率明显下降,活菌数分别减少了86.98%和99.98%,,H+-ATPase活性分别降低了13.33%和21.15%,KLDS1.9201-11表现出了更强的酸敏感性。在冷应激后,KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的活菌数分别下降了76.71%和4.88%,亲本菌株的H+-ATPase活性降低了4.27%,突变菌株的H+-ATPase活性上升了29.71%,这说明突变菌株的冷适应性比亲本菌株要好,这有利于直投式发酵剂的制作过程中活菌数的提高。使用天根公司的DNA提取试剂盒提取KLDS1.9201-11第一代至第八代的基因组DNA,并利用筛选出的5种引物对提取出的基因组DNA进行RAPD分析。利用5种引物进行的突变菌株的RAPD分析产生的DNA指纹图谱结果表明,在连续传代8次后,突变菌株KLDS1.9201-11的基因组DNA指纹图谱基本没有变化,随机扩增条带数相同且亮度接近,说明其基因组DNA具有高度的同源性,并没有随着菌株弱后酸化能力的丢失而发生变化。通过高效液相色谱的方法对KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的第一代到第十代的菌液中代谢产物进行分析,代谢产物包括葡萄糖和乳酸。结果表明,KLDS1.9201的葡萄糖代谢率始终比KLDS1.9201-11高,乳酸产量也高。且KLDS1.9201-11能够稳定遗传至第八代,到九代开始回复突变。选用嗜热链球菌KLD3.9210分别与KLDS1.9201和KLDS1.9201-11进行混合培养制作酸奶。感官评定结果表明,无论在滋味/气味、组织状态和色泽等方面这两种酸奶都没有明显的差异。贮存试验结果表明,在4℃下保存21天后,使用KLDS1.9201-11制备的酸奶样品pH降至4.13,滴定酸度升至93°T,而使用KLDS1.9201制备的酸奶pH已降至3.94,滴定酸度升至1140T。