论文部分内容阅读
目的:对体外培养的人牙周膜干细胞(hPDLSCs)施加适宜时间及大小的静压力后,通过检测BMP9诱导下hPDLSCs成骨相关因子ALP、RUNX2、OCN的基因、蛋白表达量及钙盐结节的生成,探讨BMP9对静压力作用下hPDLSCs成骨分化的影响。方法:1、对hPDLSCs采用组织块培养法培养、有限稀释法分离纯化,然后对获得的hPDLSCs进行鉴定,并为后续实验提供实验细胞;2、取第3代的hPDLSCs制成密度为1×10~5个/ml的细胞悬液,接种于六块孔板内。采用CCK-8法和流式细胞术分别检测不同静压力(0、1、2、3、5g/cm~2)作用不同时间(12h、24h、72h)后hPDLSCs的增殖活性和细胞周期,然后综合分析两者的结果,探讨利于hPDLSCs增殖的静压力加载的适宜力值与作用时间。3、构建过表达BMP9的腺病毒(Ad-BMP9)载体,并检测Ad-BMP9转染hPDLSCs的适宜MOI值(感染复数,multiplicity of infection,MOI)。随后对Ad-BMP9转染后的hPDLSCs施加适宜大小及时间的静压力,并设置病毒阴性对照组及空白对照组,分别采用RT-qPCR和Western Blot检测各细胞组成骨相关因子ALP、RUNX2、OCN的基因和蛋白表达,用茜素红染色实验检测hPDLSCs成骨诱导后钙盐结节的生成。结果:1、对经组织块培养法培养、有限稀释法筛选纯化后得到的细胞进行鉴定,鉴定内容包括:细胞克隆形成能力检测、细胞周期检测、干细胞表型及来源检测、细胞多向分化能力检测等,实验结果证实本实验所培养的细胞正是hPDLSCs。2、适宜大小的静压力(1、2、3 g/cm~2)在一定时间(12h、24h)内加载时,hPDLSCs的OD值及PI值均增加,表明细胞的增殖活性增加;当加力时间延长至72h,hPDLSCs的OD值及PI值均减小,表明细胞的增殖活性降低,且能在3 g/cm~2力值组观察到细胞崩解现象。较大的静压力(5 g/cm~2)短时间(12h)加载后,hPDLSCs的OD值及PI值增加,表明细胞的增殖活性增加;但随着加力时间的延长(24h、72h),hPDLSCs的OD值及PI值会随之下降明显,表明细胞的增殖活性明显降低,同时显微镜下观察可见大量细胞崩解死亡。3、对实验结果进行综合分析显示:体外hPDLSCs静压力加载的适宜力值为3g/cm~2,适宜加力时间为24h。此加力模式能促进hPDLSCs的增殖。4、Ad-BMP9转染hPDLSCs的适宜MOI值为80,转染时间为72h。Ad-BMP9实验组细胞的生长曲线与对照组进行比较,结果表明:MOI值为80时,Ad-BMP9对细胞的毒性作用很小,对细胞的增殖不会抑制反会增强。5、3g/cm~2的静压力加力24h后,Ad-BMP9实验组hPDLSCs的BMP9的基因和蛋白含量都明显增加,表明过表达BMP9的腺病毒载体构建成功。同时Ad-BMP9实验组hPDLSCs成骨相关因子ALP、RUNX2、OCN的基因和蛋白表达量及成骨诱导后钙盐结节的生成量均明显高于对照组,说明适宜静压力作用下,BMP9对hPDLSCs的成骨分化具有增强作用。结论:本实验成功地培养、获得hPDLSCs,并利用重物加载模型,确定“力值3g/cm~2,加力时间24h”为促进体外hPDLSCs增殖的适宜静压力加载方式。随后验证了Ad-BMP9对hPDLSCs的转染效果,并证实:适宜静压力作用下,BMP9能上调hPDLSCs成骨分化因子ALP、RUNX2、OCN基因及蛋白的表达,同时能增强hPDLSCs成骨分化晚期钙盐结节的矿化。本实验表明适宜静压力作用下,BMP9对hPDLSCs的成骨分化具有诱导增强的作用。