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目的:探讨冻存复苏对肝细胞凋亡影响;预培养对冻存大鼠原代肝细胞凋亡保护作用,研究提高冻存复苏后肝细胞活力新方法,为改良肝细胞冻存库提供理论依据,促进肝细胞移植治疗应用和推广。方法:选择体重150～200g SD雄性大鼠,采用改良Seglen原位胶原酶灌注法分离原代肝细胞,检测新鲜分离肝细胞、直接冻存后复苏肝细胞和经预培养后冻存复苏的细胞活性指标MTS,氧化应激反应指标SOD、MDA,流式细胞仪检测凋亡率检测以及Western-blot检测凋亡相关基因Caspase-3表达水平。结果:(1)各组肝细胞凋亡率比较:直接冻存组与空白对照组相比,直接冻存组肝细胞复苏后凋亡百分率显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。预培养组与直接冻存组比较,预培养处理组肝细胞复苏后凋亡百分率减少,差异有统计学意义(P<0.05)。预培养组与空白对照组相比,预培养组肝细胞复苏后凋亡百分率增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)各组肝细胞MTS比较:直接冻存组、预培养组及空白对照组三组间肝细胞细胞活性差异有统计学意义(P<0.05)。直接冻存组与空白对照组相比,直接冻存组肝细胞细胞活性下降,差异有统计学意义(P<0.05)。预培养组与空白对照组比较,两组间肝细胞细胞活性差异无统计学意义(P>0.05);与直接冻存组比较,预培养组肝细胞复苏后增殖活性增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)各组肝细胞SOD、MDA比较:①直接冻存组、预培养组及空白对照组三组间肝细胞内SOD含量差异有统计学意义(P<0.05)。直接冻存组与空白对照组相比,直接冻存组肝细胞内SOD含量下降,差异有统计学意义(P<0.05)。预培养组与直接冻存组比较,预培养组肝细胞内SOD含量升高,差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组比较,预培养组肝细胞内SOD含量下降,差异有统计学意义(P<0.05);②直接冻存组、预培养组及空白对照组三组间肝细胞内MDA含量差异有统计学意义(P<0.05)。直接冻存组与空白对照组相比,直接冻存组肝细胞内MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。预培养组与空白对照组比较,预培养组肝细胞内MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05);与直接冻存组比较,预培养组肝细胞内MDA含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。氧化应激是冻存复苏中损伤肝细胞的原因之一(4)各组肝细胞Caspase-3蛋白的表达比较改变:直接冻存组、预培养组及空白对照组三组间肝细胞Caspase-3蛋白表达灰度扫描值差异有统计学意义(P<0.05)。直接冻存组与空白对照组相比,直接冻存组肝细胞Caspase-3蛋白表达灰度扫描值显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与直接冻存组比较,预培养组肝细胞Caspase-3蛋白表达灰度扫描值减低,差异有统计学意义(P<0.05)。预培养组与空白对照组比较,预培养组肝细胞Caspase-3蛋白表达灰度扫描值增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.冻存复苏后大鼠肝细胞内氧化应激反应水平升高。2.大鼠肝细胞冻存复苏后凋亡率升高。3.大鼠肝细胞冻存复苏后凋亡效应酶Caspase-3蛋白高表达。4.预培养可减少冻存复苏后大鼠肝细胞凋亡率,并增加其活性。5.预培养可降低冻存复苏后大鼠肝细胞凋亡效应酶Caspase-3蛋白表达。