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目的:研究葡萄籽提取物原花青素(oligomeric proanthocyanidins,OPC)对正常表皮黑素细胞黑素合成的影响;通过研究OPC对紫外线辐射后人表皮黑素细胞内活性氧自由基(ROS)清除、细胞周期变化以及黑素合成关键酶表达的影响,以探讨OPC对紫外线辐射后黑素细胞黑素合成的影响及可能存在的光保护机制。
观察驱虫斑鸠菊黄酮对体外培养的人表皮黑素细胞(melanocytes,MC)黑素合成和酪氨酸酶活性的影响,并初步探讨其可能的作用机制。
用原子力显微镜观察人表皮黑素细胞(MC)、角质形成细胞(keratinocytes,KC)单独培养以及MC和KC共培养的表面结构变化以及α-促黑素(α-MSH)对细胞表面形态的影响。
方法:培养的正常表皮黑素细胞和经15mJ/cm2紫外线辐射后的表皮黑素细胞分别以高中低(10、50、100μg/mL)三种浓度的OPC作用72 h,测定细胞增殖率、黑素含量,酪氨酸酶活性。
培养的正常表皮黑素细胞经15mJ/cm2紫外线辐射后分别以高中低(10、50、100μg/mL)三种浓度的OPC作用24h后,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率;采用二氯荧光素二酯(DCFH-DA)标记法测定细胞内ROS水平;碘化丙啶( PI)、溴脱氧尿苷(BrdU)双标记结合流式细胞仪检测细胞周期;免疫印迹法测定细胞酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)蛋白含量。
选择高、中、低3种浓度(30、10、3μg/ml)的驱虫斑鸠菊黄酮作用于体外培养的人表皮黑素细胞,MTT法测定药物对细胞增殖率的影响,观察对黑素细胞的形态、酪氨酸酶活性、黑素含量的影响。免疫印迹法测定药物作用前后MC酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)蛋白表达的变化。
分别纯化培养来自人包皮的表皮MC和KC,MC以自配的添加MC生长物质的MCDB153培养基培养,KC以KC无血清培养基(K-SFM)常规培养。传第2代后以1:10的比例将两细胞接种到3×3cm的小培养皿中,以K-SFM培养基继续培养,单独或混合培养的细胞经添加含或不含100nMα-MSH的培养基干预3d后,0.5%戊二醛固定10min,原子力显微镜常温常压下,触摸式扫描。
结果:OPC对正常表皮黑素细胞的增殖和黑素合成无明显影响,但可呈浓度依赖性抑制紫外线辐射后的表皮黑素细胞的黑素合成,并能减轻紫外线辐射对细胞增殖的抑制作用。
OPC可呈浓度依赖性地保护受紫外线辐射的黑素细胞存活率、清除紫外线诱导的黑素细胞内活性氧自由基的产生;≥50μg/mL OPC可减少黑素细胞内IYR、TRP1的蛋白表达量、修复紫外线辐射后下降的TRP2蛋白表达;减少紫外线辐射后G1期细胞比例,增加S期细胞比例。
≥90μg/ml驱虫斑鸠菊黄酮可明显抑制MC的增殖;试验浓度范围内可明显促进MC黑素合成和酪氨酸酶活性增加,并以浓度依赖方式促进TRP-1的蛋白表达,但对TYR、TRP-2的表达没有影响。
正常人表皮MC有3个树突,每个树突有明显的二级分枝,除主干和分支见到膨出的颗粒物质,我们在树突的侧缘底侧和顶端还发现有丝状伪足结构,经α-MSH刺激后树突明显变长、变细,主干和分支表面膨出颗粒物质更为密集,许多已脱离枝干,丝状伪足则未有明显变化。表皮KC表面可见许多片状或钩状突起。共培养后,KC与MC接触部位可见明显的丝状伪足样结构,未连接部位则未见到丝状伪足样结构,添加α-MSH后,两细胞连接处的丝状伪足样结构明显增多。
结论:天然寡聚体OPC对紫外线辐射的黑素细胞有光保护作用,它可明显抑制紫外线辐射后表皮黑素细胞的黑素合成,而对正常表皮黑素细胞的黑素合成无影响。
天然寡聚体OPC可能通过抑制细胞内ROS的产生、减少黑素合成关键酶的表达、修复停滞于细胞分裂前期状态的细胞来发挥对黑素细胞的光保护作用。
驱虫斑鸠菊黄酮在体外能直接刺激表皮MC黑素合成,上述变化可能通过促进TRP-1的蛋白表达和TYR的翻译后修饰作用来完成。
通过胞吐和丝状伪足输送可能是黑素小体从MC向KC传递的两种主要方式,α-MSH可能通过促进这两种结构的发生而发挥促黑素传递的作用。