研究背景及目的肝癌(Liver cancer)是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤,是我国最常见的恶性肿瘤之一。全球每年新发肝癌约为56万例,我国占其中近1/2,为欧美国家的5-10倍。在我国肝癌的病死率占恶性肿瘤病死率第二位,占全球肝癌死亡人数的53%,其中肝癌男性死亡率达14.52/10万,女性死亡率达5.61/10万,且发病率和死亡率呈逐渐上升的趋势,发病年龄结构也逐渐年轻化,其中肝细胞肝癌(hepatocellular carcinomas, HCC)占原发性肝癌的90%以上。目前HCC的常规筛查和诊断方法包括病理检查、影像学检查及实验室检查,病理学检查是诊断肝癌的金标准,实验室检查一般是对血清甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)检测。手术切除目前仍然是肝癌的主要治疗手段,但是接受根治性手术的肝癌患者5年生存率<10%,因此早期诊断和治疗对肝癌病人的预后起着决定性的作用。肝癌的早期诊断率还需提高,目前临床上公认为血清AFP为较可靠的肝癌血清标志物。文献中报道,AFP对于HCC患者的诊断特异度在85-95%,灵敏度为41-97%,而阳性预测值徘徊在9-58%之间。更为重要的是,临床上有20-30%的HCC患者血清AFP水平并不升高,从而大大限制了其在HCC临床检查中的应用价值。此外,在筛选有慢性病毒肝炎背景下的肝癌时,AFP的特异性和敏感性显得相对较低,其假阴性和假阳性均可影响肝癌的正确诊断。因此,我们仍需要寻找敏感、特异的与AFP互补诊断价值并具有治疗开发价值的肝癌早期分子标志物,建立肝癌早期相关血清蛋白谱显得十分迫切。寻找新的有助于早期诊断的肿瘤血清标志物一直是备受关注的研究热点。最近的研究发现,sun等运用MALDI-TOF-TOF质谱鉴定三个肝癌细胞系和一个正常肝细胞系组分中三倍以上差异的蛋白质点,意外地发现了一个在AFP阴性肝癌细胞系中特异性高表达的蛋白质,并经质谱鉴定为膜蛋白2(AnnexinA2)。Annexin A2是annexins家族的一个重要成员,是钙离子依赖的磷脂结合蛋白,也叫膜联蛋白II、ANXA2、P36、LIP2、LPC2、胎盘抗凝集蛋白Ⅳ等。人类Annexin A2基因长约40kb,定位于15q21-q22,含有13个外显子,该基因编码出分子量为36kDa含有339个氨基酸的蛋白。此蛋白分子存在于细胞内和细胞外,在细胞中主要以三种形式存在：单体、异源二聚体(与3-磷酸甘油激酶结合)和四源二聚体(两个Annex in A2亚单位与两个P11亚单位结合,AIIt),单体位于胞质或细胞核,异二聚体位于细胞核,AIR位于胞质或细胞膜。在正常肝脏组织、慢性肝炎组织、HCC癌旁、HCC癌组织四种样品中检测Annexin A2的mRNA、蛋白水平及其定位,发现正常肝组织和慢性肝炎组织中很少检测到Annexin A2,但不管是在HCC癌旁还是癌组织中,Annexin A2在转录和翻译水平都是明显过表达的,并且在HCC癌组织和癌旁组织中的表达要高于正常组织。Annexin A2的表达主要定位于癌细胞,尤其是在低分化的HCC中。HCC分化等级越低,Annexin A2的表达越高。鉴于Annexin A2在HCC癌、癌旁和正常肝组织组织中表达的显著差异,考虑可以将Annexin A2作为HCC的一个候选标志物。免疫组化检测结果显示,把Annexin A2的表达检测添加到已建立的HCC标志谱(GPC3、GS和Hsp70)中,增加了检测高分化HCC的精确性(74%的灵敏度,100%的特异性)。进一步研究发现,Annexin A2-GPC3组合和Annexin A2-GS组合优于其他标志物组合。总之,把Annexin A2这个新生血管的敏感而特异性标志-添加到已经建立的诊断标准组合中,增加了肝脏或组织检查中HCC诊断的可靠性和客观性,且特别提高了在微量组织样本中HCC诊断的精确性。Annexin A2作为HCC的一个新的血清学候选肿瘤标志物与AFP存在不同,Annexin A2的表达异常与是否乙型肝炎病毒(HBV)感染、分化程度、TNM分期、是否肝外转移和静脉血栓有关,HBsAg (+)、中低级分化、TNMⅢ-Ⅳ、有肝外转移和静脉血栓时/Annexin A2的表达量要升高,但是与性别、年龄、肿瘤体积和AFP量多少都无关,Annexin A2在HCC患者的血清和组织中的表达量都上调,且在HCC患者的早期就明显的升高。资料显示,Annexin A2可能是HBV相关的HCC的一个早期血清标志物,把它加入目前已有的HCC标志物中将会提高对HCC的准确性和客观性,给临床带来方便。HCC的高发病率和高死亡率越来越受到大家的关注,目前大量研究表明Annexin A2与HCC的发生发展有着密切联系,其不仅参与HCC的发生,更促进HCC的侵润和转移,在HCC中Annexin A2的RNA及蛋白表达水平均高于正常肝细胞要,更为重要的是Annexin A2在HCC患者血清中的表达量显著高于正常血清,以上实验结果均提示Annexin A2有可能成为HCC的一个新型肿瘤候选标志物。时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术,是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体,因镧系稀土离子具有独特的荧光特性,该技术能够获得极高的信噪比,从而具有很高的灵敏度,且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。时间分辨荧光免疫分析相对于酶免分析、放射免疫分析有更高的临床应用价值。该技术适用于各种抗原抗体的临床检测,在市场上已得到广泛应用。转化医学的理念是目前架起基础医学与临床医学之间的有效快捷桥梁。如何将前期大规模的基因功能组学、蛋白质组学及功能蛋白组学的研究成果,尽快地应用到临床研究及疾病的诊治当中,是目前生物医药及临床检验等领域所思考和关注并期望得以实施解决的问题。方法：1. Annexin A2抗原的制备：将PGEX-4T-1-ANXA2重组质粒在大肠杆菌中进行大量诱导表达,并用GST亲和层析柱纯化重组蛋白,并进行Werstern-Blot鉴定。2.抗Annexin A2单克隆抗体制备：以纯化后的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆化,获得稳定分泌的抗Annexin A2单克隆杂交瘤细胞株,并进行Western-Blot鉴定。3.配对抗体的筛选：采用双抗体夹心的方法应用时间分辨荧光免疫分析技术对制备的抗Annexin A2单克隆抗体两两配对,筛选出r及S5/S0值均高的一对单克隆抗体,并大量制备、纯化这对抗体。4.AnnexinA2时间分辨荧光免疫分析的建立：采用双抗体夹心时间分辨免疫荧光分析技术研制Annexin A2的检测试剂,对试剂的各项性能进行评价包括：工作曲线的绘制、添加回收率实验、灵敏度实验、干扰性实验、稀释回收率。结果：重组质粒PGEX-4T-1-ANXA2在大肠杆菌中表达出Annexin A2重组蛋白,分子量约为62KDa,与理论值基本符合。用市场上购买的一株单抗进行Western-Blot分析,发现特异性条带出现在62KDa处。用纯化的表达产物免疫小鼠,四次免疫后效价达到1：128000,细胞融合制备得到16株抗Annexin A2单克隆抗体,Wester-Blot结果显示,自制单克隆抗体能与天然蛋白发生特异性反应。用夹心时间分辨方法筛选出2D6和9H9一对配对抗体,并初步建立双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法试剂盒检测Annexin A2。该试剂盒特异性、抗干扰性好；分析内分析间系数分别为2.37%-6.09%,3.43%-6.91%.结论：上述结果表明,本研究将PGEX-4T-1-ANXA2重组质粒在大肠杆菌中大量表达出具有免疫活性重组蛋白；筛选、鉴定获得16株分泌抗ANXA2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并从中筛选得到一对配对抗体,用这对抗体初步建立了ANXA2时间分辨荧光免疫分析试剂并设定与评估了各项指标(灵敏度、精密度、特异性、准确性),有待进一步优化。该项目的实施,是转化医学理念的应用,既可为人类的健康产业服务,提高医疗水平,同时也可带动生物医药产业,带来可观的经济效益,具有重要的社会和经济意义。