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目的目前众多研究认为再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是T细胞功能亢进引起的自身免疫性疾病,其发病机制中最重要的环节是CD8~+细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,CTL)介导骨髓造血细胞凋亡。但是何种信号通路引起AA患者CD8~+T细胞功能亢进,目前尚不十分清楚。本文旨在研究重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia,SAA)患者外周血CD8~+T细胞中丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的表达水平,探究SAA患者CD8~+T细胞功能亢进是否与MAPKs信号通路活化有关,从而损伤SAA患者的骨髓造血。方法本文研究对象为天津医科大学总医院血液肿瘤科自2015年11月至2016年6月收治的SAA初治患者、SAA恢复期(包括完全缓解与部分缓解)患者及正常对照者。第一部分采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)的方法检测20例SAA初治患者、20例SAA恢复期患者和20例正常对照者外周血CD8~+T细胞中磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2的表达水平,与CD8~+T细胞的功能分子穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(Granzyme B)以及临床病情指标作相关性分析。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法检测10例SAA初治患者、10例SAA恢复期患者和8例正常对照者外周血CD8~+T细胞中ERK mRNA的表达水平。第二部分采用FCM的方法检测20例SAA初治患者、20例SAA恢复期患者和20例正常对照者外周血CD8~+T细胞中磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)的表达水平,与CD8~+T细胞的功能分子Perforin、Granzyme B以及临床病情指标作相关性分析。采用Real-time PCR的方法检测10例SAA初治患者、10例SAA恢复期患者和8例正常对照者外周血CD8~+T细胞中JNK mRNA的表达水平。第三部分采用FCM的方法检测20例SAA初治患者、20例SAA恢复期患者和20例正常对照者外周血CD8~+T细胞中磷酸化的P38 MAPK的表达水平,与CD8~+T细胞的功能分子Perforin、Granzyme B以及临床病情指标作相关性分析。采用Real-time PCR的方法检测10例SAA初治患者、10例SAA恢复期患者和8例正常对照者外周血CD8~+T细胞中P38 MAPK mRNA的表达水平。结果第一部分采用FCM的方法检测研究对象外周血CD8~+T细胞中p-ERK1/2的表达水平,利用平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI)的百分比表示。MFI%=(PMA刺激后p-ERK1/2的MFI)/(PMA刺激前p-ERK1/2的MFI)×100%。结果示SAA初治组、SAA恢复组外周血CD8~+T细胞中p-ERK1/2的MFI%分别为(333.50±92.83)%、(328.28±116.11)%,均较正常对照组(254.35±63.63)%表达升高(P值均<0.05)。SAA初治组与SAA恢复组相比无统计学意义。p-ERK1/2的表达水平与Granzyme B的表达呈正相关,与Perforin的表达无相关性,与PLT计数呈负相关,与ANC、Hb、Ret%等其他临床病情指标无相关性。采用Real-time PCR的方法检测研究对象外周血CD8~+T细胞中ERK mRNA的表达水平。结果示SAA初治组、SAA恢复组、正常对照组外周血CD8~+T细胞ERK mRNA的表达分别为(1.98±0.85)、(0.43±0.59)、(0.59±0.64)。SAA初治组有高于SAA恢复组、正常对照组的趋势(P值均<0.05)。第二部分采用FCM的方法检测研究对象外周血CD8~+T细胞中p-JNK的表达水平,用MFI%表示。MFI%=(PMA刺激后p-JNK的MFI)/(PMA刺激前p-JNK的MFI)×100%。结果示SAA初治组、SAA恢复组、正常对照组CD8~+T细胞中p-JNK的MFI%分别为(132.15±24.64)%、(120.10±25.16)%、(120.00±24.21)%。三组两两比较均没有统计学意义。p-JNK的表达水平与Perforin、Granzyme B的表达均无相关性,与Hb呈负相关,与ANC、PLT、Ret%等其他临床病情指标均无相关性。采用Real-time PCR的方法检测研究对象外周血CD8~+T细胞中JNK mRNA的表达水平。结果示SAA初治组、SAA恢复组、正常对照组外周血CD8~+T细胞JNK mRNA的表达分别为(5.74±4.65)、(3.83±3.81)、(0.59±0.64)。SAA初治组有高于正常对照组的趋势(P值<0.05),SAA恢复组分别与SAA初治组、正常对照组相比均没有统计学意义。第三部分采用FCM的方法检测研究对象外周血CD8~+T细胞中p-P38MAPK的表达水平,用MFI%表示。MFI%=(PMA刺激后p-P38 MAPK的MFI)/(PMA刺激前p-P38 MAPK的MFI)×100%。结果示SAA初治组、SAA恢复组、正常对照组CD8~+T细胞中p-P38 MAPK的MFI%分别为(121.91±15.90)%、(114.98±15.02)%、(105.88±7.76)%。SAA初治组较正常对照组表达升高(P<0.05),SAA恢复组分别与SAA初治组、正常对照组相比均没有统计学意义。此外p-P38 MAPK的表达水平与Perforin、Granzyme B的表达均呈正相关,与PLT、Ret%等临床病情指标均呈负相关,与Hb、PLT等其他临床病情指标均无相关性。采用Real-time PCR的方法检测研究对象外周血CD8~+T细胞中P38MAPK mRNA的表达水平。结果示SAA初治组、SAA恢复组、正常对照组外周血CD8~+T细胞P38 MAPK mRNA的表达分别为(22.11±28.15)、(12.70±17.69)、(2.31±3.22),三组间两两比较均没有统计学意义。结论1.SAA患者外周血CD8~+T细胞中ERK、P38 MAPK的表达水平均较正常对照组升高,且与CD8~+T细胞的功能分子Perforin、Granzyme B的表达呈正相关,提示ERK、P38 MAPK可能参与SAA患者CD8~+T细胞功能亢进的信号通路,与CD8~+T细胞的毒性活动有关。2.SAA患者CD8~+T细胞中ERK、P38 MAPK的表达水平均与一些临床病情指标呈负相关,提示ERK、P38 MAPK可能参与介导损伤SAA患者的骨髓造血,可能对疾病进展具有提示意义。3.SAA患者与正常对照组JNK的表达水平相比暂没有统计学意义,且与Perforin、Granzyme B的表达无相关性,与临床病情指标没有明显相关性,以上结果均提示SAA患者CD8~+T细胞功能亢进可能与JNK信号通路无关,但也不能除外JNK参与SAA患者体内其他生物学反应。4.综上所述,MAPKs亚族在SAA患者外周血CD8~+T细胞中的表达并不一致,可能参与CD8~+T细胞功能亢进的信号通路,但仍需进一步研究证实,如体外抑制SAA患者CD8~+T细胞中MAPKs的活性或敲低MAPKs在SAA患者CD8~+T细胞中的表达,再观察SAA患者CD8~+T细胞的毒性活动有无变化,可为今后的靶向治疗提供新的理论依据。此外,我们还可以继续探究MAPKs信号通路在SAA患者体内的其他生物学作用。