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第一部分小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30矿化过程中microRNA表达谱的分析目的诱导小鼠成牙骨质细胞矿化,研究小鼠成牙骨质细胞矿化过程中microRNA表达谱的改变方法体外培养小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30,使用抗坏血酸(ascorbic acid,AA)、β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate,β-GP)和地塞米松(dexamethasone,DXM)诱导成牙骨质细胞矿化。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)表达量变化来验证矿化情况。应用miRNA microarray芯片技术,分析成牙骨质细胞矿化过程中miRNA表达谱的改变。通过qRT-PCR对芯片结果进行验证。选取表达显著降低的miR-3064-3p作为进一步的研究对象。结果1.经矿化诱导液培养7天后,矿化指标明显升高,证明含抗坏血酸、β-GP和地塞米松的矿化诱导液可以诱导成牙骨质细胞矿化。2.采用miRNA microarray芯片检测小鼠成牙骨质细胞矿化过程中microRNA表达谱变化,发现表达差异明显的miRNA有336个。3.随机挑选差异表达明显的miRNA进行qRT-PCR验证,发现qRT-PCR结果与芯片结果一致,表明芯片结果是可靠的。结论成功建立了小鼠成牙骨质细胞矿化模型。应用miRNA microarray芯片发现了小鼠成牙骨质细胞矿化过程中336个表达差异明显的miRNA,并选取显著差异表达变化的miR-3064-3p进一步研究其对小鼠成牙骨质细胞矿化的调节。第二部分miR-3064-3p对成牙骨质细胞矿化的功能研究目的研究miR-3064-3p在小鼠成牙骨质细胞矿化过程中的作用方法使用抗坏血酸、β-GP和地塞米松诱导成牙骨质细胞矿化。qRT-PCR检测在此过程中miR-3064-3p的表达模式。用Lipofectamine 2000脂质体将miR-3064-3p的agomir、antagomir和NC分别转染进小鼠成牙骨质细胞,同时使用抗坏血酸、β-GP和地塞米松诱导细胞矿化。qRT-PCR检测矿化相关指标ALP和OCN的表达变化。ALP活性检测和茜素红染色分别对矿化效果进行检测,以验证miR-3064-3p对成牙骨质细胞矿化的影响。结果1.成牙骨质细胞诱导矿化过程中,随着诱导时间延长,miR-3064-3p表达逐渐降低。2.miR-3064-3p过表达可以降低成牙骨质细胞矿化相关指标表达,减少矿化结节形成。抑制miR-3064-3p表达可以升高成牙骨质细胞矿化相关指标表达,增加矿化结节形成。结论miR-3064-3p在成牙骨质细胞诱导矿化过程中表达逐渐降低。过表达miR-3064-3p可以抑制小鼠成牙骨质细胞矿化。抑制miR-3064-3p的表达可以促进小鼠成牙骨质细胞矿化。第三部分m i R-3064-3p调控成牙骨质细胞矿化的机制研究目的预测并验证miR-3064-3p是否通过靶向作用DKK1调控成牙骨质细胞的矿化,阐明miR-3064-3p/DKK1调控通路对小鼠成牙骨质细胞矿化的影响机制。方法用TargetScan和miRBase等靶基因预测软件分析得到小鼠miR-3064-3p的靶基因 DKK1(Dickkopf-related protein 1)。成牙骨质细胞转染 miR-3064-3p agomir或antagomir后用qRT-PCR和Western Blot分别检测靶基因DKK1 mRNA和蛋白水平的变化,明确miR-3064-3p对靶基因DKK1的调控作用。将含有miR-3064-3p结合位点的靶基因DKK1 3’ UTR片段克隆到pmirGLO载体上,构建野生型报告载体pmirGLO-DKK1-WT。由公司合成并构建了含有突变靶位点的突变型报告载体 pmirGLO-DKK1-MUT。将这两个载体分别与 miR-3064-3p agomir 或 agomir NC共转染293e细胞,检测荧光素酶活性变化以证实DKK1是否为miR-3064-3p的靶基因。将人工合成DKK1蛋白分别与miR-3064-3p agomir共同转染成牙骨质细胞,qRT-PCR检测矿化相关指标的变化,通过检测DKK1是否可以逆转由miR-3064-3p引起的对成牙骨质细胞矿化的抑制来判断miR-3064-3p对成牙骨质细胞矿化的调控是否通过DKK1进行。结果1.TargetScan和miRBase等靶基因预测软件预测DKK1为miR-3064-3p作用的靶基因。2.与转染NC对照组相比,转染miR-3064-3p agomir可以降低DKK1 mRNA和蛋白水平,转染miR-3064-3p antagomir可以升高DKK1 mRNA和蛋白水平。3.与转染 NC 对照组相比,miR-3064-3p agomir 和 pmirGLO-DKK1-WT 共转染组的萤火虫荧光素酶活性受到明显抑制,而miR-3064-3p agomir和pmirGLO-DKK1-MUT共转染组的萤火虫荧光素酶活性无明显变化。4.人工合成DKK1蛋白可以促进成牙骨质细胞的矿化,表现为矿化相关指标ALP、OCN的表达升高。5.人工合成DKK1蛋白可以逆转由miR-3064-3p引起的对成牙骨质细胞矿化的抑制,表现为DKK1蛋白与miR-3064-3pagomir共转染后,成牙骨质细胞矿化相关指标与miR-3064-3p agomir组有显著性差异,而与NC组无显著性差异。结论1.miR-3064-3p 抑制 DKK1 表达。2.构建了 pmirGLO-DKK1-WT和pmirGLO-DKK1-MUT双荧光素酶报告载体。3.双荧光素酶报告证实DKK1为miR-3064-3p agomir的靶基因。miR-3064-3p可以直接调控DKK1的表达。4.miR-3064-3p通过靶向作用DKK1调控成牙骨质细胞的矿化。