飞秒激光是双光子荧光显微镜等非线性成像系统的核心元素。飞秒激光在生物成像领域的应用克服了共聚焦等单光子成像的高散射缺点，实现了样品组织内600-800微米深度的高分辨率成像。但随着生命科学的发展，双光子成像面临着快速信号检测，长时间活体成像等新需求的挑战，双光子成像的局部激发特点限制了成像速度的进一步提高。单纯地通过增加激发光功率来提高信号强度，从而提高成像信噪比的方法不仅会加剧荧光样品的光漂白，而且会增加光损伤的可能性，无法实现快速信号监测等生物学应用。一些研究表明提高飞秒激光重复频率将是实现提高荧光信号强度，降低光漂白等目标的有效手段。基于脉冲分光器的原理，本论文设计了一套符合本实验室双光子成像系统应用要求，稳定性高，耦合性好的八倍腔外脉冲倍频系统，能产生82MHz、164MHz、328MHz或656MHz重复频率的飞秒激光。根据Na Ji等提出的无源脉冲分光方法，制作了由熔融石英块和空气层组成的脉冲分光器，并基于该分光器搭建了能将飞秒激光重复频率提高8倍的开架式分光系统。将该分光系统与双光子显微成像系统耦合，比较了656MHz重复频率飞秒激光与82MHz飞秒激光的双光子成像效果。实验中发现当成像速度相同荧光量相近时，超高重复频率激光降低了双光子激发过程中的光漂白速率；在脉冲能量相近时可以相应提高高重复频率激光的成像速度，并且不会使图像信噪比下降。最后使用SolidWorks软件设计、制作了结构紧凑，调节方便，移植性强的八倍分光模块。该多路分/合束光模块能方便快捷地耦合到各种基于飞秒激光的双光子成像系统，在图像信噪比不变的情况下提高系统的最大成像速度或降低荧光样品的光漂白速率。