论文部分内容阅读
背景:mi RNA(micro RNA,微小RNA)是一类内源基因编码的单链非编码小分子RNA,由19～24个碱基对(bp)组成,它能识别靶m RNA(信使RNA),并与靶m RNA的3’UTR发生完全或部分互补结合,进而发挥其降解或抑制靶m RNA翻译的功能,起到调控靶基因表达的作用,从而影响细胞的增殖、分化、代谢和凋亡。近年的研究发现,mi RNA能够作为致癌或抑癌基因从而参与肿瘤细胞增殖以及侵袭、转移的生物学过程。mi R-140(micro RNA-140)是一种在软骨组织中特异表达的mi RNA,其表达的降低与骨关节炎发生有关,并在软骨组织增生发育过程中起重要作用。越来越多的研究显示,mi R-140参与多种肿瘤类型的发生、发展过程,但其潜在的作用机制仍不明确,尚存在争议。已有研究证实,Smad3蛋白是TGF-β(Transforming Growth Factor-β)信号通路下传的第一个转录因子,可显著促进乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的侵袭和转移能力,目前的研究已证实Smad3蛋白为mi R-140的直接作用靶点,因此,mi R-140可能通过下调Smad3的表达抑制肺腺癌A549细胞的迁移和侵袭能力。目的:本实验首先验证Smad3蛋白为mi R-140的作用靶点,进一步探讨mi R-140在肺腺癌A549细胞侵袭和迁移中的影响,同时阐明Smad3蛋白与mi R-140之间的关系,以期为肺癌的诊疗提供新的候选靶点。方法:1.上调组:将mi R-140 mimics、mi R-140无关序列(mimics-NC)、Smad3小干扰RNA(si RNA-Smad3)经脂质体lipofectamine 2000转染至人肺腺癌A549细胞中;下调组:将mi R-140 inhibitor、mi R-140无关序列(inhibitor-NC)经脂质体转染至A549细胞中。2.应用实时荧光定量(q RT-PCR)检测A549细胞中mi R-140的表达水平,应用Western blot检测Smad3蛋白的表达水平,并分析mi R-140与Smad3蛋白之间的关系。3.应用划痕实验、Transwell小室检测mi R-140上调组、下调组对A549细胞侵袭和迁移能力的影响,以及Smad3下调对A549细胞侵袭和迁移能力的影响,分析mi R-140作用于肺腺癌A549细胞的调控机制。4.应用SPSS19.0软件进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.q RT-PCR实验结果显示:与对照组相比,mi R-140在转染mi R-140mimics的A549细胞中显著表达(P<0.05),提示转染成功。Western blot实验结果显示:mi R-140 mimics组中Smad3蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)。2.细胞划痕实验结果显示:mi R-140 mimics组A549细胞的迁移能力显著低于对照组(P<0.05),而与si RNA-Smad3组相比无显著差别(P>0.05)。Transwell侵袭实验结果显示:mi R-140组的穿膜细胞数与对照组相比显著降低(P<0.05),而与si RNA-Smad3组相比无显著差别(P>0.05)。3.与之相反,mi R-140 inhibitor组中Smad3蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。细胞划痕实验显示,mi R-140 inhibitor组A549细胞的迁移能力显著高于对照组(P<0.05),而si RNA-Smad3+mi R-140inhibitor组的迁移能力与对照组相比无显著改变(P>0.05)。Transwell侵袭实验显示:mi R-140 inhibitor组的穿膜细胞数与对照组相比显著增加(P<0.05),而si RNA-Smad3+mi R-140 inhibitor组的迁移能力与对照组相比无显著改变(P>0.05)。结论:1.上调mi R-140可降低Smad3蛋白的表达,相反地,下调mi R-140可升高Smad3蛋白的表达,这验证了Smad3蛋白确为mi R-140的作用靶点。2.单独上调mi R-140和抑制Smad3表达均可抑制A549细胞侵袭和迁移能力,下调mi R-140可促进Smad3蛋白的表达,可以促进A549细胞侵袭和迁移能力,下调mi R-140的同时又抑制Smad3的表达,则对A549细胞的侵袭和迁移能力无显著影响。因此,mi R-140可下调Smad3表达而抑制肺腺癌A549细胞侵袭和迁移。3.mi R-140低表达以及Smad3高表达与肺腺癌A549细胞侵袭和迁移有关,mi R-140可能成为肺癌治疗的候选靶点,为肺癌的治疗提供新思路。