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在本论文中,我们发展了一种以毛细管电泳分离为基础的、可以同时测量多种混合样品扩散系数D的新方法,并将其称为电迁移扩散谱(EDS)。我们首先进行了理论研究,推导出了以电通量为函数的扩散系数测量方程;然后依据理论研究结果,对毛细管电泳仪进行了改造,用以测量毛细管中的电流和电通量;最后借助实验室编写的软件平台换算所得的数据,给出扩散谱。EDS以扩散峰面积(即样品含量)为纵坐标、以扩散系数为横坐标作图,扩散系数可以从图上直接读出,就如从质谱图上读取质量信息一样。本方法还可以输出qD谱(g是样品所带的有效电荷)、电通量谱或常规的时间函数电泳谱图。以微量的芳香族氨基酸、甲基苯酚、硝基苯酚、芳香有机酸混合物为样品进行的研究表明,所建方法耗样少(<1 nL)、测定速度快(约10 min)、测量准确(误差<1%),优于常规测定(2.2%)。研究发现,测量的准确与两个因素有关:一是缓冲液的pH,二是内标的选择。所选的pH值需使样品及内标物的带电量达0.5e或以上,并避开样品所含可解离基团的pKa值。内标物的出峰位置应尽可能离开样品峰。在此基础上,样品浓度<10 mM)、缓冲液离子强度(8mM~20 mM)、分离电压(8 kV~20 kV)、毛细管尺寸(管径:50、75、100μm及管长:77,55,60 cm)以及系统温度(室温附近)对扩散系数的影响可以忽略。
我们还研究并建立了利用EDS测定蛋白质有效电荷的方法。以酸性蛋白BSA、中性蛋白myoglobin、碱性蛋白cytochrome C为代表,探讨了不同pH下它们的有效电荷及其与净电荷的关系。重点研究了BSA有效电荷与溶液pH值、离子强度、离子种类及BSA自身浓度的关系,发现在0.25-5 mg/mL间,BSA的有效电荷受其自身浓度以及缓冲液中离子种类的影响可略,与离子强度(1mM-25 mM)的平方根成线性关系。利用所建方法计算得到了BSA的等电点为5.4,这与文献值4.6-5.8比较吻合。BSA的有效电荷随pH变化的曲线可转换成BSA净电荷随pH变化的曲线,所得结果也与文献值很好吻合。