研究背景目前治疗骨折内固定材料主要是传统金属。传统金属植入材料最大的弊端是需二次手术取出,另外还有应力遮挡影响骨愈合,释放的离子引起组织级联炎症反应等。生物可降解高分子作为替代传统金属的内固定材料,其缺点为体内降解速度过快或过慢、机械强度不足、生物相容性不佳、导致组织炎症等。进一步研究具有良好生物力学特性、适当的降解率和生物安全性的骨科医用植入材料,已成为目前内固定研究的一个方向。镁及镁基材料具有良好生物相容性、骨传导性、可降解性,力学特性与骨组织相似等优点,使之有希望成为骨科新型可降解植入金属材料。纯镁的主要缺点是低耐蚀性,并此而产生大量的氢气,限制了它的应用。因此,提高抗腐蚀性能是目前镁合金开发的热点方向。添加合金元素是提高镁的力学性能和抗腐蚀性的重要措施,而保护性涂层能进一步提高镁的抗腐蚀性和生物相容性。研究发现多孔的AZ91D镁合金支架具有适当降解率,可刺激外周骨重建,具有较好的生物相容性。晶体LAE442镁合金具有低腐蚀率和可接受的宿主体内反应,其MgF2涂层可进一步降低腐蚀率。Ca-P涂层镁合金可被转化成羟基磷灰石HA,从而提高镁表面细胞相容性,保护镁合金不被快速腐蚀。作为一种新型的医用可降解金属材料,其生物安全性及力学特性有待实验评价。本研究采用中科院金属所研制的镁铝合金(AZ31B,3％Al,1％Zn,其余为镁)及其HA涂层和MgF2涂层来初步研究其生物学和界面螺钉的生物力学。目的1.评价镁铝合金及其涂层细胞毒性；2.评价镁铝合金及其涂层的溶血性；3.分析镁铝合金及其涂层浸提液镁、钠离子浓度和pH值；4.评价镁铝合金及其涂层的致敏性；5.评价镁铝合金及其涂层的全身毒性；6.观察镁铝合金及其涂层的降解及血清镁变化；7.评价镁铝合金及其涂层界面螺钉的生物力学。研究方法1细胞毒性实验分为8组：空白对照组(N)；100%镁铝合金浸提液组(100%M),50%镁铝合金浸提液组(50%M),25%镁铝合金浸提液组(25%M),10%镁铝合金浸提液组(10%M),HA涂层镁铝合金浸提液组(H),MgF2涂层镁铝合金浸提液组(F)和阳性对照组(P)。将L929细胞在各组的DMEM浸提液中培养1、3、5、7d。共培养192孔,每组每观察期平行操作6孔。光学显微镜下观察细胞生长状况,应用WST-1法测量吸光度(OD)。计算细胞毒性反应。应用Factorial ANOVA进行统计学分析,两两分析应用S-N-K法。检验水准α=0.05。2.溶血实验分为两次实验,第一次实验分为5组：阴性对照组(N1),镁铝合金组(M),HA涂层镁铝合金组(H),MgF2涂层镁铝合金组(F),阳性对照组(P1)。第二次实验分为9组：阴性对照组(N2),100%镁铝合金浸提液组(100%M),50%镁铝合金浸提液组(50%M),25%镁铝合金浸提液组(25%M),10%镁铝合金浸提液组(10%M),5%镁铝合金浸提液组(5%M),2.5%镁铝合金浸提液组(2.5%M),1%镁铝合金浸提液组(1%M)和阳性对照组(P2)。各组平行操作3次。按GBT 16175-2008《医用有机硅材料生物学评价实验方法》第13部分《溶血试验》进行实验。测量各样本的OD值,计算溶血率。应用one-wayANOVA对OD值进行统计学分析,两两分析应用S-N-K法。检验水准α=0.05。3.浸提液分析：镁铝合金浸提液用生理盐水稀释成100%、50%、5%的镁铝合金浸提液,计算各稀释度溶液的钠、镁离子浓度。镁铝合金浸提液稀释成100%、50%、25%、10%、5%、2.5%、1.0%的镁铝合金浸提液,计算pH值。应用one-wayANOVA进行统计学分析,两两分析应用S-N-K法。检验水准α=0.05。4.豚鼠最大剂量致敏实验：分为5组,实验组：镁铝合金组(M),HA涂层镁铝合金组(H),MgF2涂层镁铝合金组(F)；阴性对照组(N),阳性对照组(P)。对照组分别为8只豚鼠,实验组为14只豚鼠。按照GB-T 16886.10-2005《医疗器械生物学评价》第10部分《刺激与迟发型超敏反应试验》进行实验。观察激发阶段去除贴附片后6h、24 h、48 h、72 h豚鼠皮肤致敏情况,计算致敏率和平均反应值；去除贴附片后72 h活检皮肤观察显微结构。5.全身毒性试验：分为4组：镁铝合金组(M),HA涂层镁铝合金组(H),MgF2涂层镁铝合金组(F),阴性对照组(N)。每组5只小白鼠。按GBT 16175-2008《医用有机硅材料生物学评价实验方法》第8部分《急性全身毒性试验》进行实验。观察注射后小白鼠一般情况,测量小白鼠实验前后体重,应用one-way ANOVA进行统计学分析。检验水准α=0.05。6.植入实验：将24只兔子随机分为4组：镁铝合金组(M),HA涂层镁铝合金组(H),MgF2涂层镁铝合金组(F)和聚乳酸组(PLA)。在兔子股骨髁外侧植入直径3mm,长10mm的圆销。术后观察兔子的活动、进食、睡眠、创口及皮下气肿。术后4 w、12 w各处死12只,每组3只。将处死兔子的对侧股骨髁外侧植入4种材料的圆销,每组3个样本,作为术后当天观察期。植入的股骨远端进行X线拍片、CT扫描。术前1d、术后1d、3d、1w、2w、4w、8w、12w对M组进行抽血化验,测量血清镁离子浓度,应用one-way ANOVA进行统计分析,两两分析应用S-N-K法。检验水准α=0.05。7.界面螺钉生物力学实验：分为5组：镁铝合金界面螺钉组(M),HA涂层镁铝合金界面螺钉组(H),MgF2涂层镁铝合金界面螺钉组(F),钛合金界面螺钉组(T)和聚乳酸界面螺钉组(PLA)。每组10个界面螺钉在猪的胫骨上重建前叉韧带,进行生物力学测试。计算伸长度、抗拉刚度及最大负载(失效力),应用one-way ANOVE进行统计学分析,两两比较用S-N-K法分析。失效方式应用卡方检验进行分析。检验水准α=0.05。结果1细胞毒性实验1.1形态分级：各观察期N组、10%M组、25%M组、50%M组、H组和F组的形态分级为0级。P组部分细胞悬浮,细胞量较少,为3级。100%M组：1st d观察期：细胞贴壁生长良好,细胞未完全伸展,无细胞悬浮,细胞量较少,为1级。3rd d、5th d、7th d：细胞破坏、溶解,未见完整细胞存在,为4级。1.2各组各观察期内OD值均有统计学差异(F=230.883,P=0.000)。1st d：100%M组(0.286±0.008)OD值低于N组(0.406±0.022)(P<0.05),而高于P组(0.240±0.002)(P<0.05)。50%M组(0.454±0.027)、25%M组(0.430±0.017)、10%M组(0.451±0.029)和H组(0.430±0.024)OD值均高于N组(0.406±0.022)(P<0.05),而F组(0.413±0.016)与N组(0.406±0.022)OD值无显著性差异(P>0.05)。3rd d：25%M组(1.307±0.035)、10%M组(1.324±0.037)与N组(1.317±0.042)OD值无显著性差别(P>0.05),高于(P<0.05)50%M组(1.201±0.057)、F组(1.429±0.096)和H组(1.097±0.089)OD值,所有实验组OD值均高于P组(P<0.05)。5th d：50%M组(1.466±0.124)、25%M组(1.518±0.125)、10%M组(1.581±0.039)、F组(1.429±0.096)、H组(1.379±0.067)和N组(1.622±0.156)OD值处于同一水平(P>0.05),均高于P组(0.270±0.015)(P<0.05)。7th d：50%M组(0.856±0.092)、25%M组(1.026±0.088)、10%M组(0.998±0.215)、F组(0.928±0.040)、H组(0.845±0.068)和N组(0.995±0.070)OD值在同一水平(P>0.05),均高于P组(0.281±0.006)(P<0.05)。细胞生长曲线示,除100%M组和P组外,各实验组OD值随时间延长而增加(N组：F=205.636,10%组：F=114.192,25%M组：F=220.161,50%组：F=165.200,H组：F=220.975,F组：F=216.079；所有P=0.000),第5天达到最高峰后下降。而P组始终保持低OD值。1.3细胞培养的相对增值率：1st d观察期：除100%M组(70.6%)和P组(59.2%)细胞毒性为2级外,50%M组(111.9%)、25%M组(106.0%)、10%M组(111.1%)、H组(106.1%)和F组(101.7%)均为0级。3rd d观察期：10%M组(100.5%)细胞毒性为0级,50%M组(91.1%)、25%M组(99.2%)和H组(83.3%)为1级,虽然F组(79.7%)为2级,但其值靠近1级标准,P组(22.1%)为4级。5th d观察期：50%M组(90.4%)、25%M组(93.6%)、10%M组(97.5%),F组(88.1%)和H组(85.0%)细胞毒性为1级,P组(16.6%)为4级。7th d观察期：10%M组(100.2%)和25%M组(110.0%)细胞毒性为0级,50%M组(97.5%)、F组(93.2%)和H组(84.9%)为1级,P组(28.2%)为4级。2.溶血反应实验：未稀释浸提液实验的M组溶血率为68.3%。H组和F组分别为-0.6%和0.8%。稀释浸提液实验的100%M组、50%M组、25%M组、10%M组和5%M组溶血率分别为65.3%、66.7%、33.8%、11.8%和6.2%；2.5%M组和1%M组分别为0.3%和-0.3%。3.浸提液分析：镁离子随着稀释度加大,镁离子浓度呈下降趋势,而钠离子则无明显波动。各组间pH值有显著性差异(F=5.526,P=0.004)。100%M(10.10±0.29)、50%M(10.32±0.21)、25%M(10.40±0.17)、10%M(10.38±0.11)、5%M(10.29±0.12)和2.5%M(10.05±0.12)之间pH值没有显著性差别(P>0.05),均高于1%M(9.65±0.28)(P<0.05)。4.最大剂量致敏实验：N组、M组、F组和H组去除贴附片后6 h,皮肤均出现不同程度的红斑。24 h、48 h和72 h后N组、M组、F组和H组皮肤均无红斑。阳性对照组可见明显红斑。光镜下观察N组、M组、F组和H组无皮肤水肿,无棘细胞层水肿,血管周围真皮和表皮无弥漫的单核细胞浸润,可见少量散在少量的嗜碱性细胞。P组可见皮肤水肿,棘细胞层水肿,血管周围真皮和表皮单核细胞浸润,见较多嗜碱性细胞。5.全身毒性试验：M组、H组、F组和N组动物体重增加百分比分别为：3.27%±9.19%、0.15%±2.86%、-0.71%±3.50%和1.57%±10.21%。各组动物体重变化均不超过10%,组间小鼠体重增加百分比无显著性差异(F=0.289,P=0.832)。6植入试验6.1术后兔子一般情况：所有兔子麻醉清醒后活动良好,进食正常,睡眠良好,术后创口愈合良好,无皮下气肿,各组均未见圆销周围纤维囊形成。6.2 X线拍片植入后当天拍片,各组圆销与周围骨组织接触较紧密,植入物与骨组织间未见间隙。植入4w后,PLA组、H组和F组圆销与骨组织紧密结合,形状无明显改变。M组圆销与骨组织有空白间隙。植入12w后,PLA组和H组圆销与骨组织紧密结合,圆销无明显形状改变。M组圆销与骨组织有空白间隙,较4w明显。F组圆销与骨组织之间有薄层空白间隙。6.3 Micro CT平扫植入后当天,各组圆销与周围骨组织接触较紧密,植入物与骨组织无空白间隙,植入物边缘规则平滑。植入4w,各组圆销周围均有一薄层高密度骨质影。PLA组、H组和F组圆销与骨组织紧密结合,形状无明显改变。M组圆销与骨组织有空白间隙。植入12w,各组圆销周围均有一薄层高密度骨质影。PLA组和H组圆销与骨组织紧密结合,形状无明显改变。M组圆销与骨组织有空白间隙,较4w明显。F组圆销与骨组织之间有薄层空白间隙。6.4 M组术前1d、术后1d、3d、1w、2w、4w、8w和12w血清镁离子浓度无显著性差别(F=1.081,P=0.410)。7.界面螺钉生物力学实验：所有样本均顺利通过循环实验,循环过程中无样本失效。M组、F组、H组、T组和PLA组的位移分别为：1.70 mm±0.33 mm、1.89 mm±0.53 mm、1.73 mm±0.26 mm、1.97 mm±0.72 mm和1.49 mm±0.52 mm;刚度分别为：119.58 N/mm±25.71 N/mm、116.91 N/mm±19.34 N/mm、118.74 N/mm±24.10 N/mm、107.64 N/mm±23.24 N/mm和125.18 N/mm±21.61 N/mm;最大负载分别为：522.75 N±80.33 N、573.60 N±109.73 N、545.59 N±96.71 N、484.72 N±97.06 N和639.39 N±153.96 N。循环前后位移和刚度均无显著性差别(F=1.389,P=0.253；F=0.774,P=0.548)。最大负载各组间有显著性差别(F=2.772,P=0.038),两两比较示T组最大负载小于PLA(P<0.05),而M组、H组、F组之间无显著性差别(P>0.05),与T无显著性差别(P>0.05),失效方式为韧带断裂与骨块滑出。各组失效方式无统计学差异(χ2=4.935,P=0.294)。H组和F组螺钉涂层界面基本保存完整,脱落涂层只出现在螺纹锐利缘和螺钉尾,余部分涂层完整。结论1、体外实验可见未稀释镁铝合金浸提液有细胞毒性和溶血率,考虑到镁合金本身的特性和体内的情况,体外实验不能说明镁合金的体内实验结果。2、镁铝合金HA涂层和MgF2涂层镁铝合金无细胞毒性和溶血率。3、镁铝合金、HA涂层镁铝合金和MgF2涂层镁铝合金无致敏性和急性全身毒性反应。4、镁铝合金植入后3个月仅有少量降解,MgF2涂层镁铝合金的涂层在3个月时已完全降解,HA涂层镁铝合金的涂层在3个月时仍对镁铝合金起保护作用。镁铝合金植入体内镁离子浓度无明显变化。植入后4种材料均无皮下气肿和纤维囊形成。5、镁铝合金及其HA涂层和MgF2涂层界面螺钉重建前叉韧带的力学达到临床要求的初始固定力量。6、镁铝合金及其MgF2涂层和HA涂层可有效减缓镁铝合金的腐蚀率,其涂层具有良好的生物相容性。7、对高腐蚀率的镁合金金属材料,应修订新的体外生物学评价方法。8、本研究为镁铝合金及其涂层作为骨科植入物的应用提供生物安全性依据,为进一步研究及临床应用提供实验依据。9、镁铝合金及其HA涂层和MgF2涂层具有成为骨科新型医用可降解植入材料的可能。