恶臭假单胞菌KT2440是一种非致病性的革兰氏阴性菌,具有广泛的代谢多样性和对不同环境的强适应性。自被分离发现以来,KT2440作为模式菌株经常被用于通用的基础代谢途径的研究,除此之外,KT2440及其衍生菌株还被广泛地应用于各种生物技术应用中,如污染物的生物修复和特殊化学合成物的生产等。生物被膜的形成和运动性是菌株存活于复杂环境中的重要能力,也与KT2440及其衍生菌株在生产实践中的效果有着密切联系。对KT2440生物被膜形成和运动能力的调控进行研究,能帮助和指导其在实际生产中的应用。环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）是广泛存在于细菌中的一种核酸类第二信使,参与调节原核生物中多种生理活动,例如在调节菌体生物被膜状态和运动状态的转变中起着重要作用。C-di-GMP促进生物被膜基质成分编码基因的表达,抑制鞭毛及运动能力相关基因的表达,但不同细菌中生物被膜的组成成分有很大差别,关于KT2440中c-di-GMP影响哪些生物被膜基质成分编码基因的表达,以及c-di-GMP调控这些基因的表达的机理尚不清楚。细菌胞内c-di-GMP的浓度水平是由具有合成活性的二鸟苷酸环化酶（DGC）和降解活性的磷酸二酯酶（PDE）控制的。Bif A是假单胞菌中一个保守的c-di-GMP降解酶,其在KT2440胞内c-di-GMP水平的维持中起着重要作用,Gcb A是假单胞菌中一个保守的c-di-GMP合成酶,以前研究表明这两个酶的功能都涉及到菌株的生物被膜形成和游动性,但关于它们在胞内如何被调控的过程尚不清楚。本文重点探究了恶臭假单胞菌KT2440中c-di-GMP对生物被膜形成的调控机理,以及两个c-di-GMP代谢酶（Bif A和Gcb A）的调控和它们在生物被膜形成和游动能力中的作用。结果概括如下:1.恶臭假单胞菌KT2440中c-di-GMP通过FleQ调控生物被膜基质编码基因lapA和bcs的表达从而影响生物被膜的形成前人研究发现在多种细菌中c-di-GMP从转录及翻译后水平正向调控菌株生物被膜基质成分的表达,从而促进生物被膜的形成,但关于恶臭假单胞菌KT2440中c-di-GMP如何调控这些生物被膜成分的表达尚不明确。本文首先探究了KT2440中c-di-GMP对生物被膜形成和游动性的影响,结果和其他菌株中的一致:高水平c-di-GMP促进生物被膜形成,抑制菌株游动性;低水平抑制生物被膜形成,增强菌株游动能力。然后,通过比较高/中/低胞内c-di-GMP水平的菌株中生物被膜基质编码基因的表达差异,发现c-di-GMP调控生物被膜基质中的四种成分编码基因（lap A、lap F、bcs和pea）的表达,其中对lap A、bcs和pea的表达有促进作用,对lap F的表达则为抑制效果,而且c-di-GMP对lap A和bcs操纵子表达影响的程度远大于对pea和lap F的影响。进一步研究表明,c-di-GMP对lap A和bcs操纵子的调控依赖于受体调节因子Fle Q,而对lap F和pea表达的调控不依赖Fle Q。表型观察结果表明Fle Q缺失导致菌株生物被膜形成能力丧失,且c-di-GMP对生物被膜形成的调控很大程度上是依赖Fle Q的,即c-di-GMP通过Fle Q调控生物被膜基质编码基因lap A和bcs的表达从而控制生物被膜的形成。最后,通过EMSA实验验证了Fle Q能够在体外结合lap A和bcs的启动子DNA,说明Fle Q对其调控是直接的,且添加c-di-GMP可促进Fle Q与lap A启动子的结合,抑制Fle Q与bcs操纵子启动子的结合。2.Fli A通过调控c-di-GMP降解酶Bif A的表达增强菌株游动能力鞭毛介导的运动性是菌株在营养缺乏等严峻环境下得以生存的重要能力。Bif A是参与假单胞菌中胞内c-di-GMP浓度调节的重要降解酶,缺失bif A导致菌株中c-di-GMP水平显著上升。前期有报道在恶臭假单胞菌KT2440中BifA的表达受鞭毛sigma因子Fli A(σ²⁸)的影响。本研究首先用实验结果确认了sigma因子Fli A对Bif A的表达调控,Fli A突变体中bif A的表达下降一半。然后通过分析bif A启动子序列,发现其中除Fli A保守结合序列外,还含有一个Rpo D保守结合序列,暗示了bif A的表达受两种sigma因子调控,具有两个转录起始位点。5’-race对bif A转录起始位点检测的结果证明了这一假设,在两个sigma因子识别的保守序列后面约10个碱基处都发现了转录起始位点。另外,通过对启动子中的关键碱基进行突变,发现bif A启动子中Fli A保守结合序列确实对于启动子活性有重要作用。-10区的替换和间区截短的突变均导致启动子活性下降,其中间区截短的突变导致启动子活性降低一半,和Fli A缺失的效果相似,说明间区截短完全废除了Fli A对bif A启动子的作用,而-35区的碱基替换突变对启动子活性无明显影响。Bif A是KT2440中的c-di-GMP降解酶,且对胞内c-di-GMP浓度有重要影响,因此Fli A极有可能通过控制Bif A的表达而影响胞内c-di-GMP水平。通过检测和比较缺失和超表达fli A对胞内c-di-GMP浓度的影响,发现缺失fli A对c-di-GMP无显著影响,而超表达Fli A则导致胞内c-di-GMP浓度下降。且超表达Fli A的这种作用在bif A缺失突变体中没有观察到,说明超表达Fli A降低胞内c-di-GMP水平是依赖于降解酶Bif A的。表型检测分析结果显示在野生型中超表达Fli A导致菌株游动性增强,而在bif A缺失突变体中则无此效果,说明超表达Fli A可以通过增强bif A的表达降低胞内c-di-GMP浓度,进而导致菌株游动性的增强。另外,超表达Fli A对菌株生物被膜形成能力没有显著影响。3.Fle Q响应胞内c-di-GMP水平调控合成酶Gcb A的表达Gcb A是假单胞菌属中一个保守的c-di-GMP合成酶,在荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌中的研究结果表明Gcb A主要影响菌株生物被膜形成和鞭毛介导的运动性。本研究通过同源比对,找到了KT2440中的gcb A同源基因pp₀563,然后通过对pp₀563突变体胞内c-di-GMP水平检测和表型观察,发现其产物具有c-di-GMP合成酶活性,其功能主要涉及生物被膜形成初期粘附和菌株游动性能力,对生物被膜的成熟过程无显著影响,与之前报道的在荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌中功能类似,因此将PP₀563命名为Gcb A。另外发现,在转录调节因子Fle Q缺失突变体中gcb A表达显著下调,互补菌株中表达正常,说明gcb A的表达受Fle Q调控。同时胞内c-di-GMP浓度对gcb A表达有显著影响,低水平c-di-GMP促进gcb A的表达,而高水平则抑制其表达;而在缺失fle Q后,c-di-GMP的这种作用消失,说明c-di-GMP对gcb A表达的调控是依赖Fle Q的。进而EMSA实验的结果表明Fle Q可以在体外和gcb A的启动子结合,且添加c-di-GMP会对结合产生抑制作用,说明Fle Q确实可以通过结合到gcb A启动子上,直接调控gcb A的表达,且这种结合调控是受c-di-GMP影响的。Fle Q的拮抗因子Fle N也参与gcb A表达的调控,Fle N缺失导致gcb A表达上调。另外,通过构建sigma因子Rpo N缺失突变体和Fle Q点突变互补质粒检测了Rpo N及Fle Q的ATPase活性对于gcb A和另外四个生物被膜基质编码基因表达的作用。结果表明,Rpo N和Fle Q的ATPase活性对于gcb A和lap A的完全表达是必需的,对于鞭毛基因fle SR和fli F的表达是严格必需的,而对于bcs操纵子的表达是不需要的。本文的结果确定了c-di-GMP在KT2440生物被膜形成和游动性中的作用及机理,并揭示了代谢酶Bif A和Gcb A的作用及表达调控,本文的结果为以后进一步研究KT2440中c-di-GMP及其代谢酶的功能,及其胞内c-di-GMP浓度如何被调控等问题奠定了基础。