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茶树起源于中国,是一种重要的经济作物,其体内含有的大量次生代谢产物,如茶多酚、茶多糖、咖啡碱等具有重要的保健作用。本研究以低咖啡碱、高茶多酚含量的南昆山毛叶茶以及高咖啡碱、高茶多酚含量的英红九号为研究材料,分别构建了这2个茶树品种的cDNA文库,通过设计探针,从南昆山毛叶茶cDNA文库中筛选出了三个CHS基因,并进行了初步的分析,为进一步研究CHS基因及其它相关功能基因奠定了基础。本研究结果如下:
1.南昆山毛叶茶cDNA文库的构建以高可可碱、低咖啡碱、高茶多酚的茶树品种南昆山毛叶茶为材料,利用ZAPExpress文库试剂盒构建方法,成功地构建了南昆山毛叶茶的cDNA文库,原始文库滴度达到了6.0x105pfu/mL,重组率达到了97.3%,扩增文库滴度达到了1.9×109pfu/mL,PCR扩增检验插入片段大小。结果显示:92.6%的原始文库的插入片段大小在750bp以上。文库构建质量较好。
2.英红九号cDNA文库的构建以低可可碱、高咖啡碱、高茶多酚的广东省级良种英红九号为材料,利用ZAPExpress文库试剂盒构建方法,成功地构建了英红九号的cDNA文库。原始文库的滴度达到了5.0x105pfu/mL,重组率达到了95.5%,扩增文库滴度达到了4.0x1010pfu/mL。文库构建质量较好。
3.南昆山毛叶茶CHS基因的筛选通过RT-PCR方法制备英红九号CHS基因探针,筛选南昆山毛叶茶cDNA文库,获得了3个南昆山毛叶茶CHS候选基因,分别命名为PCHS1、PCHS2、PCHS3、三个基因长度分别为1432bp、1075bp、645bp。其中PCHS1为全长基因,开放阅读框长度为1170bp。
4.CHS候选基因的比对分析通过与NCBI网站上的序列比对分析发现,PCHS2与PCHS1仅相差一个核苷酸序列,同源性高于99%;PCHS3与PCHS1的同源性仅为85%,尤其3’非翻译区的差别较大。进一步分析还发现获得的全长基因PCHS1与NCBI上登录的CHS基因D26595.1的同源性最高,达到98%;与其它已提交茶树CHS基因的同源性在80%以上;与柑橘、胡桃、烟草、牵牛花等植物的CHS基因的同源性在70%以上。采用blastp软件进行氨基酸的比对分析,发现与序列号为p48388的氨基酸的同源性高达98%,与胡桃、山梨、菠萝等植物中的CHS氨基酸序列的同源性也都在90%以上。