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[目的]:研究尼古丁对人Vγ9Vδ2-T细胞杀伤肿瘤细胞活性的影响,并进一步研究其作用途径及分子机制。[方法]:通过密度梯度离心法获取健康志愿者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC);应用帕米磷酸盐(Pamidronate,PAM)联合人重组白介素2(Interleukin-2,IL-2)体外扩增Vγ9Vδ2-T细胞,并用流式细胞术检测其扩增前后免疫表型及细胞因子的表达量;使用流式细胞术检测经磁珠纯化后Vγ9Vδ2-T细胞的纯度;利用Western blot及免疫荧光法检测尼古丁受体α7-nAchR在Vγ9Vδ2-T细胞中的表达;Vγ9Vδ2-T细胞经梯度浓度尼古丁处理后,利用AnnexineV-PI法检测其凋亡水平;选取无吸烟史的健康志愿者的PBMC,在使用PAM联合IL-2特异性扩增Vγ9Vδ2-T细胞的同时,加入100μM尼古丁或PBS,每3天检测Vγ9Vδ2-T细胞在细胞培养物中的比率和细胞绝对数目,并于体外扩增14天后检测其免疫表型及细胞因子表达量的变化;其后将不同处理组扩增的Vγ9Vδ2-T细胞纯化后,与K562细胞按不同的靶效比(E:T)共孵育4h,经碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色后,利用流式细胞术检测K562细胞的死亡率;为进一步分析经尼古丁处理后Vγ9Vδ2-T细胞杀伤肿瘤细胞能力的变化,将Vγ9Vδ2-T细胞与K562细胞共培养4h后,检测Vγ9Vδ2-T细胞的免疫表型及细胞因子表达量的变化情况。[结果]:PAM联合IL-2可于体外特异地扩增并显著提高人Vγ9Vδ2-T细胞的活性;经免疫磁珠法纯化后,Vγ9Vδ2-T细胞纯度大于97%,可用于下一步实验;经Western blot及免疫荧光法检测后发现,在新鲜分离的Vγ9Vδ2-T细胞及体外扩增的Vγ9Vδ2-T细胞表面均表达尼古丁受体α7-nAchR;高浓度的尼古丁(1mM)显著影响Vγ9Vδ2-T细胞的生存活性,而在低浓度尼古丁(100μM)处理组中未观察到此现象;同时,我们发现100μM尼古丁可以明显抑制Vγ9Vδ2-T细胞的增殖活性,导致其扩增比率及扩增数目的显著降低(p<0.05);经100μM尼古丁处理的Vγ9Vδ2-T细胞,在靶效比为10:1、20:1时,对K562肿瘤细胞的杀伤能力受到显著抑制(p<0.05);与PBS对照组相比,尼古丁处理后的Vγ9Vδ2-T细胞与K562细胞按1:1比例共孵育后,Vγ9Vδ2-T细胞的Fas配体(Factor associated suicide ligand,Fas L)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)、CD107a及穿孔素(Perforin)的表达明显下调。[结论]:在体外扩增的Vγ9Vδ2-T细胞中检测到α7-nAchR受体的表达,且低浓度尼古丁(100μM)无法影响Vγ9Vδ2-T细胞的生存活性;经尼古丁处理后,Vγ9Vδ2-T细胞的增殖能力显著降低,更为重要的是其肿瘤杀伤能力受到明显的抑制;通过进一步研究,我们发现尼古丁负调控Vγ9Vδ2-T细胞杀伤肿瘤细胞活性的主要分子机制是通过结合于细胞表面的尼古丁受体后,下调Vγ9Vδ2-T细胞表面FasL、TRAIL的表达水平;另外Vγ9Vδ2-T细胞表面CD107a表达量的下调,以及胞内穿孔素表达水平的降低也提示我们,尼古丁也可以通过直接调控细胞毒性相关效应因子的分泌水平,显著破坏Vγ9Vδ2-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。以上研究结果提示了尼古丁可以抑制Vγ9Vδ2-T细胞的细胞毒活性,可能是造成吸烟人群中Vγ9Vδ2-T细胞免疫监控能力低下,继而导致肿瘤细胞逃逸和肿瘤高发生率的重要潜在因素之一。