论文部分内容阅读
目的：确定BACE1基因启动子的核心区域，寻找对于BACE1基因的转录起着关键作用的顺式作用元件和最小启动子区域，揭示BACE1基因核心启动子的结构并研究相应的功能。方法：在前期研究的基础上继续构建含有不同区域的BACE1基因启动子-荧光素酶报告基因载体。用常规方法培养人胚肾细胞HEK293，用Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine2000将构建的含有不同区域的BACE1基因启动子-荧光素酶报告基因载体转染HEK293并使其在细胞内表达荧光素酶。用Promega公司的双荧光素酶检测试剂测定细胞裂解液荧光素酶的活性并用内参照载体的活性进行校准，最终活性比值反映BACE1基因启动子的活性，然后比较其活性在不同载体之间的差异，确定具有启动子活性的最小区域的5’端边界和3’端边界。在此基础上，以p3BU-1149/-400或p3BU-583/-400为模板，通过基因定点突变确定BACE1候选顺式作用元件的核心序列，通过构建相应的反向突变质粒来验证顺式作用元件的功能，并研究各顺式作用元件间的相互作用。结果：成功构建一系列含有不同区域的BACE1基因启动子-荧光素酶报告基因载体，最长的插入片段为874bp，包含BACE1的翻译起始位点上游1273到400的序列，即B1U-1273/-400，继续删切并转染，5’删切分析发现-583/-574和-560/-540这两个区域有可能含有启动子功能发挥所需的元件。3’删切分析发现-480可能是BACE1启动子活性所必需的。-510/-480对于BACE1的启动子活性起着关键作用。-550/-480可能是BACE1基因的启动子核心区域。通过基因定点突变发现578G/A，510A/C附近各存在一个功能性的顺式作用元件区域而且各顺式作用元件在影响BACE1启动子活性方面具有协同作用，将这两个顺式作用元件序列分别命名为TCE1，TCE2，TCE1是一个高度保守的近端激活因子，TCE1与核心启动子之间间隔的碱基个数而不是碱基的种类对基因的转录有重要作用，TCE2与BACE1的基础转录密切相关。通过查询数据库及5’RACE的结果发现BACE1的核心启动子区域不含有任何已知的经典核心启动子元件。结论：通过实验已经成功找到了BACE1基因启动子的核心区域，而且确定了两个控制BACE1转录的关键元件TCE1，TCE2，这两个元件可以相互作用，其中TCE1是一个高度保守的近端激活因子，TCE2与BACE1的基础转录密切相关。最终发现BACE1的核心启动子区域不含有任何已知的经典核心启动子元件，这提示还需更深入的研究来揭秘其核心启动子区域的结构和功能。