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研究目的:动脉瘤(Aneurysm)是指血管局部的异常膨大,通常由血管损伤性病变导致动脉壁变薄引起,肿块具有波动性,外形似瘤样组织,因此称动脉瘤。动脉瘤可以发生在任何血管,其中致死率高的动脉瘤有:脑部Willis环的动脉瘤、胸主动脉瘤以及腹主动脉瘤。心肌梗死心脏也会发生动脉瘤比如房间隔动脉瘤和心室动脉瘤。由于血流动力学和解剖学特征,在所有的主动脉瘤中腹主动脉瘤的发生率和破裂率最高。老年和男性腹主动脉瘤发生的两大主要危险因素,同时吸烟和高血压也是其发生重要的危险因素。血管壁的慢性炎症、平滑肌细胞的凋亡和细胞外基质的破坏性重塑是腹主动脉瘤的重要组织病理学特征。因此,抑制血管炎症反应、减少平滑肌细胞凋亡和维持细胞外基质稳态,可能会抑制腹主动脉瘤的发生和改善腹主动脉瘤的预后。有研究发现,在人腹主动脉瘤组织样本中转化生长因子(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)信号通路被抑制;在动物模型中,给予TGF-β1中和性抗体刺激,能够明显加重腹主动脉瘤病情。以上研究结果提示:TGF-β信号通路的激活可能在腹主动脉瘤中起保护作用,但具体的作用机制尚不清楚。因此,本课题研究主要目的有两点:(1)阐明TGF-β信号通路在腹主动脉瘤中发挥保护作用的具体机制是什么;(2)寻找TGF-β信号通路中与腹主动脉瘤发生相关的关键基因,为腹主动脉瘤的防治提供新靶点。方法结果:细胞实验:给予人血管平滑肌细胞(Human Vascular Smooth Muscle Cell,HVSMC)重组蛋白TGF-β1(5 ng/mL)刺激,收集不同时间点的细胞,运用实时聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行基因表达检测,分析TGF-β信号通路中与腹主动脉瘤发生相关的基因表达情况,以期发现表达差异的基因。实验结果表明:TGF-β1能够显著增加潜在转化生长因子结合蛋白4(Latent Transforming Growth Factor beta Binding Protein 4,LTBP4)的表达量,进一步运用蛋白免疫印迹(Western blot)检测LTBP4蛋白水平,发现其蛋白水平与转录水平变化一致,呈增加趋势。有研究表明LTBP4参与弹性蛋白的组装过程,具有促进弹性纤维形成,增加血管弹性的作用,而弹力板的断裂和细胞外基质的降解正是腹主动脉瘤的主要病理特征。因此,我们提出如下科学假说:TGF-β1促进血管平滑肌细胞分泌LTBP4进而促进弹性纤维形成起到保护腹主动脉瘤的作用。有研究表明,TGF-β1主要通过激活转录因子SMADs发挥作用,使SMADs磷酸化转位入核,调控下游靶基因表达,而YAP作为转录共激活因子,入核后与某些特定转录因子结合,调控基因的转录。本实验室之前的研究表明,YAP在动脉粥样硬化进展以及血管新生中有着重要作用,而腹主动脉瘤发病过程中有很多危险因子也在动脉粥样硬化中起作用。因此,为了探究YAP是否参与TGF-β1对LTBP4转录的调控,我们用TGF-β1刺激人血管平滑肌细胞,运用Western blot检测与YAP出入核功能密切相关的三个磷酸化位点的磷酸化状态以及YAP核定位的变化。实验结果表明:TGF-β1能够以时间和剂量依赖的方式使YAP357位点的酪氨酸磷酸化,促进YAP转位入核,运用蛋白免疫共沉淀(CoImmunoprecipitation,CO-IP)方法检测蛋白之间相关作用,我们发现YAP能够与转录因子p-SMAD2/3直接结合,以上结果提示YAP可能参与TGF-β1调控LTBP4转录的过程。为了进一步验证YAP是否在TGF-β1对LTBP4的转录调控过程中发挥重要作用,我们在人血管平滑肌细胞中进行YAP腺病毒过表达和YAP siRNA沉默实验。实验结果表明:YAP可以对LTBP4进行转录调控;TGF-β1可以通过促进YAP蛋白和p-SMAD2/3转位入核的方式来上调LTBP4的表达。动物实验:有研究表明LTBP4参与弹性蛋白的组装,能够促进弹性纤维形成,增加血管弹性,所以我们在动物模型上选用弹性蛋白酶诱导的腹主动脉瘤模型,验证YAP对LTBP4的转录调控是否在腹主动脉瘤的形成中起保护作用。我们构建了平滑肌细胞特异性过表达YAP小鼠,首先检测过表达小鼠血管中LTBP4的表达,与细胞实验结果一致:过表达YAP小鼠血管中LTBP4的表达量显著增加。将过表达YAP小鼠(8周龄)和野生型小鼠(8周龄)分为以下四组:过表达YAP小鼠(弹性蛋白酶手术组,假手术组),野生型小鼠(弹性蛋白酶手术组,假手术组),术后2周统计成瘤率、瘤体直径以及弹力板的断裂情况。实验结果表明:平滑肌细胞特异性过表达YAP能明显改善弹力蛋白酶诱导的腹主动脉瘤的严重程度。综上所述,本研究阐明了TGF-β1在腹主动脉瘤中的保护作用是通过上调LTBP4表达增加弹性蛋白的组装,进而增加动脉瘤稳定性并抑制动脉瘤持续扩张。在这一过程中YAP作为转录共激活因子起关键作用,可以作为防治腹主动脉瘤新的靶点。