目的:用组织工程学原理,通过体外分离扩增人表皮干细胞作为种子细胞,复合自己制备的异种(裸鼠)脱细胞真皮支架材料,探讨体外构建活性组织工程皮肤的可行性。将该组织工程皮肤移植于实验动物创面,检测和了解该组织工程皮肤的结构和功能。方法:用中性蛋白酶消化法,分离小儿包皮的表皮,制成单细胞悬液, IV型胶原快速粘附10-15min (370C),分别取快速粘附细胞和未黏附的细胞培养。用K-SFM培养基,补充10%的干细胞培养专用胎牛血清(FBS)。用免疫组织化学测定角蛋白15(CK15)、角蛋白19(CK19)和β1整合素(β1-integrin)和用流式细胞仪检测CD71等指标,对进表皮干细胞行鉴定。以胰蛋白酶法制备(裸鼠)脱细胞真皮支架,并进行组织学观察。将分离培养传代的表皮干细胞接种于铺好IV型胶原的脱细胞真皮表面,置入干细胞培养体系培养后,再行气液界面培养构建组织工程皮肤。HE染色切片观察组织工程皮肤结构。将组织工程皮肤移植于实验动物创面,以单纯脱细胞真皮移植作对照。肉眼观察移植后的创面情况,对移植后的皮肤取材行组织学观察及免疫组织化学鼠抗人广谱角蛋白染色确定组织来源。结果:1.表皮干细胞能被IV型胶原快速黏附;2.黏附的细胞在培养皿中后很快贴壁,第3-4d形成一些小集落,其后细胞逐渐增殖,至第7d左右逐渐有大集落形成。而未黏附的细胞集落形成早1-2d,集落形成数明显少于实验组。黏附细胞免疫组织化学染色阳性率CK15为50.80%+1.81、CK19为51.40%+2.22、和β1-integrin为51.40%+1.90,CD71阳性率约1.91%+0.21。黏附细胞具有表皮干细胞特性,阳性率与文献报道的差别不大。3、制备的脱细胞真皮支架呈乳白色,柔软有弹性,光镜下见表皮去除,真皮内无其他细胞成分,胶原纤维结构保存完好,排列有序。4、表皮干细胞能快速黏附到由IV型胶原包被的脱细胞真皮支架上,迅速贴壁生长,无排斥反应。联合培养约两周后,可融合形成含1-2层细胞的复合皮。5、活性复合皮移植于实验动物的创面后,创面愈合良好,未见排斥反应,创面收缩不明显; 4周后,移植皮肤取材切片HE染色,光镜下见创面愈合,皮层含2-3层细胞,胶原排列整齐,未见皮肤附属结构。组织工程皮肤鼠抗人广谱角蛋白染色为阳性反应,对照组染色阴性,鼠皮广谱角蛋白染色阴性,说明移植皮肤的皮肤结构来源于实验用的人体种子细胞,表皮干细胞向表皮细胞分化。脱细胞真皮组无表皮结构形成,表面逐渐干燥、变硬,创面收缩,3周后创面愈合。组织取材HE染色未见表皮层结构形成,为红染的疤痕样组织,鼠抗人广谱角蛋白染色为阴性反应。结论:1、表皮干细胞能被IV型胶原快速黏附,利用这一特性,可以用来筛选表皮干细胞,并在K-SFM培养体系中分裂增殖,产生大量的子代细胞,可作为皮肤组织工程的种子细胞。2、胰蛋白酶法制备的异体脱细胞真皮,能去除表皮层及真皮内各种细胞成分,胶原纤维结构保存完好,可作为组织工程用脱细胞真皮支架材料。3、扩增、传代的第二代表皮干细胞能快速黏附在预铺好IV型胶原的脱细胞真皮上,在表皮干细胞培养体系中生长,联合气液界面培养,能构建活性复层结构的人工皮肤。4、构建的活性组织工程皮肤能修复实验动物创面,4周后的组织学检测显示,表皮干细胞分化为表皮细胞,组织内未见有皮肤附属结构形成。