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目的:1,2-二氯乙烷(1,2-dichloroethane,1,2-DCE)系卤代烃类化合物,属于高毒类化学物质,具有脂溶性,主要用于合成聚氯乙烯单体,还可以作为有机溶剂用于粘合剂、脱脂剂和清洗剂等。职业性接触主要经呼吸道后快速分布到全身各组织器官,脑组织是其主要蓄积和损害的靶器官。神经毒性是人类急性或亚急性1,2-DCE暴露后最常见的毒性作用,中毒性脑病为其主要临床表现,脑水肿为其主要病理过程。2-氯乙醇(2-chloroethanol,2-CE)作为中间代谢产物,具有比1,2-DCE更强的生物毒性,故2-CE很可能在1,2-DCE神经毒性作用中发挥重要作用。小胶质细胞(microglia,MG)是大脑中常驻的免疫细胞,有研究表明,MG活化后产生的炎症介质参与脑水肿的形成,但具体机制尚未阐明。因此,本研究中以BV2小胶质细胞系为研究对象,探究2-CE暴露对BV2细胞活化的影响以及p38丝裂活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路在2-CE暴露所致BV2细胞活化中的作用,研究结果对于揭示亚急性1,2-DCE中毒性脑水肿的机制具有重要科学意义。研究方法:1、BV2细胞2-CE暴露模型的建立:以小鼠小胶质细胞系BV2细胞为研究对象,使用含有40、60、80、100、120、140、160、180、200、220和240m M 2-CE暴露12 h,用MTS试剂盒检测BV2细胞活力,确定后续实验中2-CE暴露浓度。2、2-CE暴露对BV2细胞的影响:不同浓度2-CE暴露12 h后,用正倒置一体显微镜观察BV2细胞形态并拍照。收集细胞,采用Western blotting法检测BV2细胞中Iba1、CD11b、TNF-α、IL-6、IL-10、i NOS、p-p38、p38、p-p65和p65蛋白表达水平,采用q RT-PCR法检测BV2细胞中Iba1、CD11b、p38和p65 m RNA表达水平。收集培养基,采用ELISA法检测TNF-α、IL-6和IL-10的分泌水平。采用免疫荧光染色法检测BV2细胞核和胞质内p-p65荧光强度。3、p38 MAPK信号通路在2-CE暴露所致BV2细胞活化中的作用:采用p38 MAPK信号通路抑制剂SB202190对BV2细胞中p-p38进行抑制,将BV2细胞随机分为空白对照组、抑制剂对照组、2-CE暴露组和抑制剂干预组。空白对照组不予任何处理;抑制剂对照组给予10μM SB202190处理12 h;2-CE暴露组给予160 m M 2-CE暴露12 h;抑制剂干预组提前用10μM SB202190暴露1 h,干预结束后给予2-CE暴露12 h。后续各检测指标同上。结果:1、BV2细胞2-CE暴露模型的建立:MTS法检测结果显示,160、180、200、220和240 m M 2-CE暴露组的BV2细胞活力均显著低于对照组(P<0.05),故后续体外实验采用0、40、80和160 m M 2-CE为暴露浓度,12 h为暴露时间。2、2-CE暴露对BV2细胞活化的影响:2-CE暴露后,分枝状BV2细胞减少,细胞突起回缩,变大变圆,呈“阿米巴样”。2-CE暴露上调BV2细胞中Iba1和CD11b蛋白表达水平及m RNA表达水平(P<0.05),提示2-CE暴露致BV2细胞活化。3、2-CE暴露对BV2细胞中p38 MAPK信号通路的影响:2-CE暴露上调BV2细胞中p-p38和p-p65蛋白表达水平,而各浓度2-CE暴露组的BV2细胞中p38和p65蛋白表达水平及m RNA表达水平无统计学差异。分别检测BV2细胞核和胞浆蛋白中p65蛋白表达水平,结果显示,与对照组相比,各浓度2-CE暴露组的BV2细胞核中p65蛋白表达水平显著升高,而胞质中p65蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。此外,免疫荧光结果显示,随2-CE暴露浓度的增加,BV2细胞核内p-p65荧光强度越强,提示2-CE暴露可激活BV2细胞中p38 MAPK信号通路及其下游核转录因子NF-кB。4、2-CE暴露对BV2细胞炎症因子表达水平的影响:2-CE暴露上调TNF-α和IL-6在BV2细胞中的蛋白表达水平及培养基上清液中的分泌水平,上调BV2细胞中i NOS蛋白表达水平,降低IL-10在BV2细胞中的蛋白表达水平及培养基上清液中的分泌水平(P<0.05),提示2-CE暴露导致BV2细胞促炎症因子表达水平增加。5、p38 MAPK信号通路在2-CE暴露致BV2细胞活化中的作用:与160 m M 2-CE组相比,SB202190干预可降低BV2细胞中Iba1和CD11b蛋白表达水平及m RNA表达水平,降低BV2细胞中p-p38、p-p65、TNF-α、IL-6和i NOS蛋白表达水平,降低培养基上清液中TNF-α和IL-6分泌水平,上调IL-10在BV2细胞中蛋白表达水平及培养基上清液中的分泌水平(P<0.05)。此外,SB202190干预后BV2细胞核内的p-p65绿色荧光强度减弱。提示2-CE暴露可能通过激活p38 MAPK信号通路导致BV2细胞活化。结论:1、2-CE暴露可激活BV2细胞并使其分泌过量的促炎性因子。2、p38MAPK信号通路及其下游核转录因子NF-кB参与调控2-CE暴露所致BV2细胞活化。