【摘 要】
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目的:研究FXa是否通过抑制anoikis来影响肝细胞癌的侵袭及转移能力,并从线粒体的能量代谢和呼吸链途径来探讨FXa发挥作用的相关机制。方法:(1)通过qRT-PCR和WB技术检测正常肝细胞系L02和不同肝癌细胞系PLC/PRF/5、Huh-7和MGCC-97H中FXa的基因和蛋白表达水平,筛选出贴壁状态下FXa基因和蛋白比L02表达水平相对较高并且存在统计学差异的肝癌细胞株;(2)利用poly
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目的:研究FXa是否通过抑制anoikis来影响肝细胞癌的侵袭及转移能力,并从线粒体的能量代谢和呼吸链途径来探讨FXa发挥作用的相关机制。方法:(1)通过qRT-PCR和WB技术检测正常肝细胞系L02和不同肝癌细胞系PLC/PRF/5、Huh-7和MGCC-97H中FXa的基因和蛋白表达水平,筛选出贴壁状态下FXa基因和蛋白比L02表达水平相对较高并且存在统计学差异的肝癌细胞株;(2)利用poly-HEMA将L02和筛选的肝癌细胞株分别悬浮24h及48h,首先通过WB技术检测悬浮与贴壁状态下两株细胞FXa的蛋白表达水平是否有差异;然后用流式方法检测同等条件下两株细胞的凋亡是否存在统计学差异;(3)利用特异性shRNA慢病毒及FXa特异性抑制剂Rivaroxaban下调FXa,然后用流式细胞仪检测FXa下调对肝癌细胞凋亡的影响;其次通过Transwell及划痕实验检测FXa下调对肝癌细胞侵袭及迁移能力的影响;(4)通过WB和ELISA技术验证糖酵解及线粒体氧化磷酸化途径中的乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸脱氢酶激酶(PDKs)及活性氧簇(ROS)的调控是否是FXa发挥作用的机制之一。结果:(1)qRT-PCR和WB结果显示:与L02相比,在贴壁状态下FXa在MHCC-97H中的表达量最高且具有统计学差异(P<0.05);(2)WB结果显示:L02细胞在悬浮24h及48h后FXa的表达无明显变化(P>0.05),而MHCC-97H细胞在悬浮24h后表达量显著升高(P<0.05),在48h后降低(P<0.05);流式结果显示:在贴壁状态下,L02与MHCC-97H的凋亡无明显差异(P>0.05),但在悬浮24h及48h后MHCC-97H细胞的凋亡均显著低于L02(P<0.05);(3)流式结果显示:FXa下调后MHCC-97H细胞在贴壁和悬浮状态下的凋亡率均显著增加(P<0.05);Transwell及划痕实验结果显示:FXa下调后MHCC-97H细胞的侵袭及迁移能力均受到显著抑制(P<0.05);(4)WB和ELISA结果显示:FXa下调后LDH的活性随悬浮时间延长而显著增加(P<0.05);而ROS活性在贴壁及悬浮状态下均显著降低(P<0.05);PDK1和PDK2表达量在悬浮后均显著增加(P<0.05),而PDK3和PDK4的表达量在悬浮前后无显著差异(P>0.05)。结论:(1)FXa具有抑制肝细胞癌anoikis的作用;(2)FXa可以促进肝细胞癌的侵袭及迁移;(3)线粒体的能量代谢和呼吸链途径中的LDH、ROS及PDK1/2的调控可能是FXa抑制肝细胞癌anoikis作用的机制之一。
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