棉铃虫(Helicoverpa armigera)是一种世界性农业害虫,现今为害范围已蔓延至欧亚大陆、大洋洲、非洲和美洲的多个地区。在我国,所有棉花种植地区都可见棉铃虫为害,此外田间种群还取食玉米、小麦、花生、大豆、辣椒等多种作物,给农业生产造成了巨大损失。1997年后我国推广种植表达Cry1Ac毒素的转基因Bt棉防治棉铃虫,有效降低了田间种群对棉花及其它寄主作物的为害。2015年我国Bt棉种植面积约占全国棉花总种植面积的96%。1997-2014年Bt棉种植18年我国农民共获得约17.5亿美元的经济收益。需要警惕的是,棉铃虫具有对Cry1Ac毒素产生抗性的能力,田间抗性演化将减弱甚至彻底消除Bt棉的效益。长期以来,Bt棉表达的高剂量Cry1Ac对田间种群进行了连续筛选,然而棉铃虫对Bt棉的抗性演化鲜有报道。根据种群的田间动态推测,自然庇护所延缓了抗性的快速演化。然而尚没有严格的大尺度数据描述和预测自然庇护所的实际效能和有效时限。2010年我国北方棉区部分田间种群抗性演化已出现早期预警。根据靶标昆虫对Bt作物抗性田间演化规律判断,不采取延缓抗性的有效措施,早期预警后抗性将快速演化。因此,亟须准确评估自然庇护所效益,检测自然庇护所影响下棉铃虫田间种群Bt抗性演化方向,并寻找适用我国田间种群的抗性治理策略。显然,这些工作的完成需要对我国田间抗性的演化方式和抗性产生的分子机理进行深入了解。因此,本文连续检测了 2011-2014年棉铃虫田间种群实际抗性频率,同时拟合数学模型预测的抗性演化趋势,揭示了北方棉区棉铃虫Bt抗性演化规律。自然庇护所延缓作用下,Bt抗性演化缓慢;然而抗性基因存在遗传多样性,非隐性抗性演化速度更快;自然庇护所影响下,抗性基因显性度上升,抗性演化向显性抗性发展。因此,本文从田间抗性个体中分离了非隐性抗性基因,纯化的抗性品系在Bt棉上表现显性抗性,并且对Cry2Ab毒素具有显著交互抗性。显性抗性相比于其它抗性更加难以防治,分子机理也不同于任何已报道机制。因此,本文利用遗传连锁分析对显性抗性基因进行QTL定位,最终获得了与抗性紧密连锁的单碱基突变型抗性候选基因。这些结果将为监测和预测棉铃虫田间种群抗性基因频率、寻求针对性的有效抗性治理策略、完善甚至重建Bt毒素作用模型起到重要推动作用。1.自然庇护所对棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性演化的影响“高剂量庇护所”策略是延缓靶标害虫对Bt作物抗性的最有效策略之一。不表达Bt毒素的非棉花寄主作物充当自然庇护所延缓了我国棉铃虫Bt抗性演化。为了明确自然庇护所的实际效能和有效时限,理解自然庇护所存在下棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性演化规律,本章大规模检测了 2011-2014年北方棉区六个省份棉铃虫田间种群实际抗性频率,模拟了 2010-2013年多因素影响下抗性演化预测趋势。模型模拟结果显示,2010年抗性个体频率为0.93%,没有非棉花作物充当自然庇护所2013年将增长至98%,而非棉花作物与非Bt棉花充当庇护所延缓抗性效能相等时增长至1.1%。田间检测结果显示抗性个体频率从2010年的0.93%增长至2013年的5.5%。抗性频率实际增长曲线与56%有效自然庇护所存在时模拟曲线吻合。自然庇护所延缓了抗性演化,但是延缓效能差于非Bt棉花。携带非隐性遗传抗性基因的抗性个体比例从2010年的37%增长至2014年的86%,同样与56%有效自然庇护所存在时模拟曲线吻合,非隐性抗性基因演化速度快于隐性抗性基因。非隐性抗性基因的平均显性度逐年升高,携带高显性度抗性基因的抗性个体比例显著上升,显性抗性可能是抗性演化的最终方向。非隐性抗性快速演化严重威胁自然庇护所的持续效益,启动种植表达两种或多种Bt毒素的“基因聚合”棉花并且配合其他抗性治理措施能够延缓抗性的持续演化。2.棉铃虫对Bt棉的显性抗性及对Cry2Ab毒素的交互抗性自1997年北方棉区种植Bt棉以来,自然庇护所持续高效延缓了棉铃虫田间种群对Bt棉的抗性演化。然而2010-2014年,部分田间种群抗性演化已经接近或超出抗性早期预警水平。非隐性抗性快速演化严重威胁Bt棉使用寿命和自然庇护所持续效益。为了制订前瞻性抗性治理策略,本章对2011年田间非隐性遗传抗性基因进行了分离,连续多代Cry1Ac筛选最终建立了抗性等位基因纯合抗性品系AY2和QX7。利用生物测定检测抗性特性,相对于敏感品系,AY2和QX7对Cry1Ac毒素分别具有1200倍和460倍高水平抗性。两个品系的抗性等位基因对Cry1Ac毒素区分剂量和表达Cry1Ac的Bt棉叶都表现为完全显性遗传。两个品系对Cry2Ab毒素都具有较低但统计学显著的交互抗性,抗性倍数分别为5.9倍和4.2倍。田间存在的显性抗性等位基因严重威胁自然庇护所延缓抗性演化的效能,显性抗性对Cry2Ab毒素敏感性较低制约了第二代基因聚合Bt棉花的应用。相对于隐性抗性演化,显性抗性演化更加难以治理。3.遗传连锁分析定位棉铃虫Cry1Ac显性抗性QTL我国北方棉区棉铃虫田间种群抗性基因存在遗传多样性,而非隐性抗性演化速度快于隐性抗性。从田间种群中分离纯化的Cry1Ac抗性品系AY2在Bt棉上表现功能性显性抗性。显性抗性是北方棉区田间Bt抗性演化的最终方向,自然庇护所策略无法延缓这一抗性演化。新型抗性治理策略的制订需要对显性抗性分子机理和遗传机制充分理解,而现有抗性机理模型无法对此进行解释。因此,本文利用遗传连锁分析对显性抗性品系AY2的抗性基因进行了数量性状位点(QTL)定位。首先,本文利用AY2与敏感品系SCD构建抗性基因交换型回交后代,利用Cry1Ac建立抗性和敏感表型,随后通过全基因组关联分析(GWAS)抓取能够显著区分抗性和敏感表型的分子标记。最终位于第10染色体(HaChr10)上的8个单碱基多态性(SNP)分子标记指示了 QTL的位置,范围为6.2-11.5Mbp。为了缩小QTL的范围,并避免由于种群量少造成分子标记差异不足而遗漏其它抗性基因,本文利用鳞翅目昆虫特有的遗传机制分别构建了抗性基因交换型和连锁型回交群体。利用Cry1Ac筛选获得携带抗性基因的回交群体,通过大规模DNA测序比较抗性群体中SNP标记与抗性基因的连锁情况。在抗性基因连锁型群体中,HaChr09和HaChr10的SNP与抗性表型紧密连锁;在抗性基因交换型群体中,HaChr09和HaChr10上的多个SNP与抗性表型紧密连锁,指示了 QTL位置,分别为2.8-4.0Mbp和10.1-11.4Mbp。两个QTL均表现显性遗传,对抗性贡献相当,命名为HaBtR-Chr09和HaBtR-Chr10。基因注释结果显示QTL中没有已报道的Bt抗性基因,这与显性抗性表型相一致。本研究首次获得了棉铃虫显性抗性QTL,证明了显性抗性机制与隐性抗性不同,为之后找寻抗性基因,揭示Cry1Ac作用机制和棉铃虫显性抗性分子机理提供了基础。4.棉铃虫四跨膜蛋白单氨基酸突变与Cry1Ac显性抗性紧密连锁棉铃虫能够通过多种途径对Cry1Ac毒素产生抗性。钙粘蛋白、ABC转运蛋白ABCC2基因突变能够引起140-1000倍抗性,这些受体突变型抗性基因通常为隐性或不完全隐性遗传。显性抗性可能是我国北方棉区棉铃虫田间种群Bt抗性的最终演化方向,然而现有分子机制均无法解释显性抗性的产生。前文利用遗传连锁分析获得了两个显性抗性QTL。为了确认显性抗性基因,本文利用与抗性紧密连锁的SNP标记HaChr09-3.7M和HaChr10-10.69M对AY2中两个抗性主效基因进行了分离,最终成功构建了分别携带HaBtR-Chr09和HaBtR-Chr10的抗性品系AY2-9和AY2-10。生物测定显示两个品系对Cry1Ac分别具有200倍和1400倍抗性。选择AY2-10进行抗性基因精细定位,利用363头抗性基因交换型回交后代抗性个体和7个SNP标记进行遗传连锁分析,成功获得了跨越物理距离0.25Mbp的QTL。利用特异引物对该QTL内21个基因进行克隆和序列比对,最终在棉铃虫四跨膜蛋白基因HaTSPAN1中发现了与抗性紧密连锁的单氨基酸突变L31S,该突变位于预测蛋白第一跨膜区TM1。设计特异引物检测实验室内多个敏感品系、隐性抗性品系和不同年份从田间分离的显性抗性品系中HaTSPAN1的预测氨基酸序列,结果显示所有显性抗性品系都具有L31S突变。AY2的BBMV与Cry1Ac的特异性结合与敏感品系SCD没有差异,而信号通路基因的抑制剂能够显著降低AY2-10的抗性,暗示了 HaTSPAN1并非Cry1Ac的功能受体,而是在增强信号转导促进中肠干细胞增殖等方面起关键作用。本文通过图位克隆首次鉴定了一个显性Bt抗性基因,该基因的发现对完善甚至重建Bt毒素作用机制模型、监测和预测棉铃虫田间种群显性抗性基因频率、寻求针对性有效抗性治理策略将起到重要推动作用。