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目的研究鹅不食草心菊内酯（Helenalin）对四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化大鼠PI3K/Akt/m TOR和NF-κB信号通路的影响,探讨Helenalin对肝纤维化的作用及其分子机制。方法1.肝纤维化大鼠模型的制备将68只雄性SD大鼠随机分成以下2个组:Ⅰ组（22只）和Ⅱ组（46只）,Ⅰ组SD大鼠灌胃给予生理盐水,Ⅱ组SD大鼠则用50%的CCl4橄榄油溶液按2m L/kg灌胃制备肝纤维化大鼠模型,共8周。第8周末随机抽取Ⅰ组大鼠2只及Ⅱ组大鼠4只进行病理学检查。确定造模成功后,将Ⅰ组大鼠随机分为正常组对照组和Helenalin对照组,将Ⅱ组大鼠随机分为肝纤维化模型组、秋水仙碱组（colchicine组）、Helenalin高剂量组（Helenalin-H）和Helenalin低剂量组（Helenalin-L）。自造模第9周起,Helenalin对照组灌胃给予Helenalin 0.5mg/kg/d,秋水仙碱组灌胃给予colchicine 0.2mg/kg/d,Helenalin高、低剂量组灌胃分别给予Helenalin 0.5、0.25 mg/kg/d,正常对照组和模型组则均灌胃给予等量生理盐水。给药治疗4周后,对各组大鼠进行腹主动脉采血,并取出大鼠肝组织备用。2.Helenalin对肝纤维化大鼠慢性肝损伤的影响使用全自动生化分析仪对大鼠血清中的谷丙转氨酶（ALT）与谷草转氨酶（AST）的活力及白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）和总蛋白（TP）的含量进行检测;在光学显微镜下观察H＆E染色和Masson染色后大鼠肝脏病理结构的改变。3.Helenalin对肝纤维化大鼠肝纤维化标志物的影响试剂盒检测大鼠肝组织中透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（HPCⅢ）、层连蛋白（LN）、IV型胶原（Col IV）以及羟脯氨酸（HYP）的含量。4.Helenalin对肝纤维化大鼠氧化应激及脂质过氧化的影响试剂盒检测各组大鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二酸（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）的水平。5.Helenalin对肝纤维化大鼠肝脏炎症反应的影响试剂盒检测大鼠肝组织中白细胞介素1β（IL-1β）、白介素10（IL-10）、白细胞介素6（IL-6）、髓过氧化物酶（MPO）以及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平。6.Helenalin对肝细胞凋亡的影响TUNEL染色实验观察Helenalin对肝细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR（RT-PCR）测定大鼠肝组织中Bax和Bcl-2 m RNA的表达;Western blot检测大鼠肝组织中Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3凋亡蛋白的表达。7.Helenalin对肝纤维化大鼠肝脏中相关胶原的影响RT-PCR检测大鼠肝组织Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲm RNA的表达;Western blot检测大鼠肝组织中α-SMA、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ等相关胶原蛋白的表达。8.Helenalin对NF-κB信号通路的影响RT-PCR检测大鼠肝组织中IκBα和NF-κBP65 m RNA的表达;Western blot检测TLR4、My D88、NF-κBP65、p-NF-κBP65、IκBα、p-IκBα、IKKα/β和p-IKKα/β蛋白的表达。9.Helenalin对PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响RT-PCR检测大鼠肝组织中PI3K和P70S6K m RNA的表达;Western blot检测FAK、p-FAK、PI3KP85、p-PI3KP85、Akt、p-Akt、P70S6K、p-P70S6K、m TOR、p-m TOR和PTEN蛋白的表达。结果1.肝纤维化模型成功制备给予CCl4造模8周后,发现模型组大鼠血清中的ALT和AST活性显著增加（P＜0.01）,TP含量以及A/G水平则显著降低（P＜0.01）;同时,H＆E染色结果表明,模型组的肝细胞出现肿胀、变性、坏死,肝小叶被破坏;此外,Masson染色结果表明,模型组中央静脉区纤维间隔变宽,胶原纤维大量形成且增粗。以上结果符合肝纤维化模型的病理特征,提示造模成功。2.Helenalin减轻CCl4所致的大鼠慢性肝损伤给药干预4周后,Helenalin能显著降低血清中ALT和AST活力（P＜0.01）,同时升高TP含量以及A/G水平。此外,Helenalin能够明显减轻肝细胞出现的变性、坏死、炎症细胞浸润现象,并能使胶原沉积显著减少,胶原间隔变窄。以上结果提示,Helenalin能够减轻CCl4所致的大鼠慢性肝损伤。3.Helenalin降低大鼠肝纤维化标志物的含量试剂盒结果显示,模型组肝组织中这些生物标志物HA、LN、HPCⅢ、Col IV和HYP的含量显著升高（P＜0.01）;经药物干预后,Helenalin均显著降低了肝组织中这些标志物的表达（P＜0.01或P＜0.05）。提示,Helenalin能减轻肝纤维化的严重程度。4.Helenalin减轻肝纤维化大鼠氧化应激及脂质过氧化反应试剂盒检测结果显示,模型组肝组织的MDA含量显著增加,SOD、CAT、GSH-Px和GR等抗氧化物物质或酶的含量显著降低（P＜0.01）;给与Helenalin干预后,Helenalin显著逆转了这些指标的异常改变（P＜0.01或P＜0.05）。以上结果提示,Helenalin能够显著减轻CCl4所致的大鼠肝组织氧化损伤。5.Helenalin减轻肝纤维化大鼠肝脏炎症反应试剂盒结果显示,模型组大鼠肝组织中IL-6、IL-1β和TNF-α含量以及MPO活力显著升高,IL-10含量明显降低（P＜0.01）;经药物干预后,Helenalin显著降低了IL-6、IL-1β和TNF-α的含量（P＜0.01或P＜0.05）,Helenalin高剂量组显著升高IL-10含量（P＜0.01）。6.Helenalin抑制肝细胞凋亡及凋亡相关基因和蛋白的表达TUNEL染色结果显示,正常对照组的肝细胞形态正常,模型组大鼠肝组织中可观察到大量的棕褐色的凋亡细胞;经Helenalin干预后,这些棕褐色的细胞数量出现了不同程度的减少。类似地,PT-PCR结果显示,模型组大鼠组织中Bax m RNA的表达显著增加,Bcl-2 m RNA的表达显著降低（P＜0.01）;经药物干预后,Helenalin显著逆转了这些凋亡相关基因的异常表达（P＜0.01）。此外,Western blot结果显示,模型组肝组织中Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达水平显著升高,Bcl-2的水平则显著降低（P＜0.01）;经药物干预后,Helenalin显著逆转了上述凋亡相关蛋白的异常表达（P＜0.01）。7.Helenalin减少肝纤维化大鼠的胶原沉积RT-PCR结果显示,模型组肝组织中Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲm RNA的表达均显著升高（P＜0.01）;经药物干预后,Helenalin高剂量组均显著降低了Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲm RNA的表达（P＜0.01）。此外,Western blot结果显示,模型组肝组织中α-SMA、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ的蛋白表达均显著升高（P＜0.01或P＜0.05）;经药物干预后,Helenalin高剂量组均显著降低了α-SMA、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白的表达（P＜0.01）。以上结果提示,Helenalin能够调控相关胶原的表达,从而减轻肝纤维化的严重程度。8.Helenalin抑制肝纤维化大鼠NF-κB信号通路的活化PT-PCR结果显示,模型组大鼠组织中IκBα和NF-κB p65 m RNA的表达显著增加（P＜0.01）;经Helenalin干预后,IκBα和NF-κB p65 m RNA的表达均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。此外,Western blot结果所示,模型组大鼠组织中TLR4、My D88、p-IKKα/β、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白的水平显著增加（P＜0.01）;经Helenalin干预后,肝纤维化大鼠肝组织中TLR4、My D88、p-IKKα/β、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白的表达均显著降低（P＜0.01）。9.Helenalin抑制肝纤维化大鼠PI3K/Akt/m TOR信号通路PT-PCR结果显示,模型组大鼠组织中PI3K和P70S6K m RNA的表达显著增加（P＜0.01）;经Helenalin干预后,PI3K和P70S6K m RNA的表达均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。此外,Western blot结果所示,模型组大鼠组织中p-FAK、p-PI3K、p-Akt、p-P70S6K和p-m TOR蛋白的表达显著增加,PTEN蛋白的表达显著降低（P＜0.05或P＜0.01）;经Helenalin干预后,p-FAK、p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白的表达均显著降低,PTEN蛋白的表达显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结论Helenalin对CCl4所致的大鼠肝纤维化具有显著的保护作用,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/m TOR和NF-κB信号通路有关。