本文中的试验鱼——蒙古鮊购自南湖渔场,健康无病,雄鱼体长23.1cm,体重151.3g;雌鱼体长为25.2cm,体重155.6g。根据已知的人和鼠ob基因序列设计引物,引物中分别引入EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点,通过RT-PCR从蒙古鮊脂肪组织RNA中扩增到ob基因片段。将此片段与pBluescrip SK(+)载体同时用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切,电泳回收各自片段后连接并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞,涂布于含IPTG、X-gal和Amp~+的琼脂糖平板,挑取乳白色的菌落,进行PCR扩增和双酶切鉴定,阳性克隆命名为pSK-ob,将此质粒送大连宝生物公司测序,首次获得蒙古鮊ob基因编码区438bp的序列。ob基因序列在不同物种之间具有很高的保守性。将此序列与人、鼠和猪的ob基因序列进行比较,发现蒙古鮊与人、鼠和猪ob基因核苷酸编码序列的同源性分别为82%、84%和99%;蒙古舶ob基因编码的蛋白leptin氨基酸序列与人、鼠和猪leptin蛋白氨基酸同源性分别为80.8%、78.8%和95.2%。定量取蒙古舶不同组织0.2g,提取其总RNA后,用半定量RT-PCR技术分析组织ob基因表达特异性,结果表明:ob基因在脂肪和肝脏组织中表达量最大,在心脏、脾脏、肌肉、脑、卵巢中表达量次之,在肾脏中表达很少,而在精巢和肠道组织中不表达。将含ob基因的克隆载体pSK-ob与表达载体pET-28a同时用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切,回收所需片段连接并转化后,涂布于含IPTG、X-gal和Kan~+的琼脂糖平板,挑出乳白色的菌落,进行PCR扩增和酶切鉴定。鉴定过的阳性克隆子命名为pET-28 a-ob,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析。在分子量20KD处有一融合蛋白,而融合蛋白前体分子量为4KD,则剩余蛋白分子量为16kD,此蛋白分子量与期望值一致,且在一定时间内,表达量随着时间的延长,蛋白含量增加。