A组轮状病毒(Rotavirus)是全球范围内引起婴幼儿肠胃炎的主要病原体之一,每年导致200万住院病例和20万死亡病例,造成了严重的社会经济负担。目前关于轮状病毒复制、致病及免疫机制等相关基础研究相对较少,主要原因是缺乏高效的轮状病毒反向遗传学系统。2017年,Komoto等建立了基于14质粒的轮状病毒反向遗传学系统。但是,目前该系统还存在效率低、所得病毒滴度较低等问题。并且,除了Komoto实验室,还没有其他实验室成功利用该系统进行病毒研究的相关报道。为了建立基于质粒的反向遗传学系统,我们按照Komoto的思路进行了 14质粒反向遗传学系统的构建尝试,但14质粒共转染细胞后未能产生感染性病毒颗粒,且未检测到病毒蛋白的表达。随后,我们对14质粒系统进行了优化。首先对转染细胞系和转染试剂进行了优化,确定所用细胞系为B SR-T7/5,所用转染试剂为XtremeGENE;其次,由于病毒双层颗粒转导细胞后可产生感染性病毒颗粒,我们尝试将病毒双层颗粒组成蛋白VP1、VP2、VP3、VP6加入反向遗传学系统。然而VP1、VP2、VP3、VP6表达质粒与1 1个转录质粒共转染后未能获得病毒颗粒;最后,考虑到14质粒共转染数量太多,转染效率低,我们设计克隆将轮状病毒的11个转录质粒减少到四个。蛋白表达情况检测结果显示四个转录质粒共转染细胞后VP2和VP6表达量均高于11质粒,并且电镜观察到胞内存在少许类病毒颗粒,但未观察到明显的病毒质区。检测NSP2蛋白表达情况,我们发现胞内无NSP2蛋白表达,这可能是未形成病毒质区的原因。另外,我们对转录质粒转录情况进行了检测,发现转录质粒所转录出的病毒RNA 3’末端存在非病毒序列。病毒基因3’末端序列准确性会直接影响基因组包装,并进一步影响到病毒颗粒的生成。综上所述,优化后的四质粒系统比14质粒系统蛋白表达水平更高,共转染细胞后可观察到少许类病毒颗粒。另外,我们发现病毒质区的形成和病毒基因序列3’末端序列准确性会直接影响重组病毒的产生。因此,本研究为建立更高效的基于质粒的反向遗传学系统提供了新的思路。