【摘 要】
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化学防治是作物病害防治的主要手段,但由于病原物抗药性问题日趋严重,导致田间防效下降,因此在新农药上市之前有必要开展病原物对杀菌剂的室内抗药性风险评估,以指导农民科学用药。已有研究报道发现,植物病原菌在实验室条件下的抗性进化机制与田间抗性菌株间存在着遗传学的差异。造成这种差异的原因可能是来自诱变因子、环境条件以及其它生物影响因素等。所以亟待研究植物病原菌在室内的抗性机制,筛选到与田间抗性菌株抗性机制
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化学防治是作物病害防治的主要手段,但由于病原物抗药性问题日趋严重,导致田间防效下降,因此在新农药上市之前有必要开展病原物对杀菌剂的室内抗药性风险评估,以指导农民科学用药。已有研究报道发现,植物病原菌在实验室条件下的抗性进化机制与田间抗性菌株间存在着遗传学的差异。造成这种差异的原因可能是来自诱变因子、环境条件以及其它生物影响因素等。所以亟待研究植物病原菌在室内的抗性机制,筛选到与田间抗性菌株抗性机制相同或相近的抗药突变体诱导方式,从而提高杀菌剂室内抗性风险评估的可靠性和准确性。本研究以灰葡萄孢（Botrytis cinerea）为供试病菌,以琥珀酸脱氢酶抑制剂（Succinate dehydrogenase inhibitors,SDHIs）类杀菌剂中的啶酰菌胺为靶标药剂,开展室内和田间灰霉病菌对啶酰菌胺抗性分子机制研究。室内通过多种诱导方法获得的灰霉病菌（B.cinerea）对啶酰菌胺（boscalid）的抗性突变体;田间从灰霉病发生严重的草莓种植地区采集分离灰霉病菌,测定其对啶酰菌胺的敏感性。比较分析灰霉病菌田间抗药性菌株与室内抗药性突变体对啶酰菌胺的分子抗性机制,获得与田间抗性菌株抗性机制相近或一致的抗性突变体,为杀菌剂抗性风险评估提供适合的室内抗药突变体的诱导方法。1、在山东草莓种植地采集、分离和纯化获得64株灰霉病菌菌株,其中有59株表现出抗性,抗性频率92.2%,有26株表现为高抗,表明灰霉病菌在田间产生抗药性十分严重。2、已报道灰霉病菌对啶酰菌胺产生抗性主要与靶标位点突变和转运蛋白外排活性增加即运输体基因的过量表达有关。田间菌株的SDHB亚基中225位脯氨酸突变为苯丙氨酸（P225F）最多,有27株,其中有1株表现为敏感,其余均表现为不同程度抗性。SDHB亚基中还存在着第272位由组氨酸突变为酪氨酸或精氨酸（H272Y/R）、第230位由天冬酰胺突变为异亮氨酸（N230I）,此外还有12株在SDHB亚基上没有氨基酸点突变。而田间菌株的SDHC亚基上均无点突变,在2株抗性菌株（J2-10/J2-11）的SDHD亚基上发现了新的突变,即第9位由缬氨酸突变为丙氨酸（V9A）。利用实时荧光定量PCR检测田间菌株的运输体基因及靶标基因表达量,其中:ABC运输体中BcAtrB基因显著上调表达的菌株最多,为47%,MFS运输体中BcmfsM2基因显著上调表达的菌株占61%,推测ABC运输体BcAtrB基因和MFS运输体中BcmfsM2基因的过量表达与灰霉病菌的抗性产生相关;而靶标基因显著上调表达的菌株数量较少,BcSdhB、BcSdhC、BcSdhD基因分别为23%、22%、13%,推测其过量表达不是菌株对SDHIs产生抗性的主要原因。3、室内诱导的36株抗药性突变体中,药剂驯化获得的15株SDHB、SDHC、SDHD亚基均无氨基酸点突变;紫外诱变获得的21株SDHB亚基中225位脯氨酸突变为苯丙氨酸（P225F）最多,占38%,其次是第272位由组氨酸突变为酪氨酸或精氨酸（H272Y/R）和第230位由天冬酰胺突变为异亮氨酸（N230I）,分别占33%和14%;另外还有3株在SDHB亚基上没有氨基酸点突变,而在SDHC和SDHD亚基中均无点突变。利用实时荧光定量PCR检测室内抗药性突变体的运输体基因及靶标基因表达量,其中:ABC运输体中BcAtrB基因显著上调表达的菌株最多,为64%;MFS运输体中BcmfsM2基因显著上调表达的菌株占81%;而靶标基因BcSdhB、BcSdhC、BcSdhD显著上调表达的菌株分别占17%、31%、33%。4、对田间和室内灰霉病菌进行了适合度分析,结果表明:（1）室内抗药性突变体中有11株比标准菌株的菌丝生长速率低,但不同抗性水平的田间菌株和室内抗药性突变体菌丝生长速率均无显著差异;（2）田间菌株的产孢量与其抗性水平呈负相关,室内抗性菌株的产孢量均低于标准菌株,但不同抗性水平的田间菌株和室内抗药性突变体产孢量无显著差异;（3）不同抗性水平的田间和室内菌株的致病力无显著差异。综上,菌株适合度不受抗性水平的影响。
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