新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）是一种非常重要的人体条件致病菌,侵入人体后,会感染囊肿性纤维化,慢性肉芽肿等。因此以新洋葱伯克霍尔德菌作为模式菌,从基因及分子层面解析微生物致病机理,给临床治疗提供理论依据。环二鸟苷酸（Bis-（3′-5′）cyclic diguanylic acid,c-di-GMP）是细菌所特有的一类核酸类第二信使,参与并调节细菌多种生物学功能,包括群集运动、生物被膜的形成以及致病因子的产生等。在洋葱伯克霍尔德菌群（Burkholderia cepaciacomplex,Bcc）中,有超过20多个不同的基因编码GGDEF、EAL或者HD-GYP结构域,这些蛋白结构域被普遍认为参与c-di-GMP的代谢。Rpf R是一个含有PAS-GGDEF-EAL结构域蛋白,研究表明Rpf R感受信号分子,调节c-di-GMP浓度变化,从而最终调节细菌生理活动。在B.cenocepacia H111中,我们用Tn5随机插入的方法筛选突变体库,找到了一个群集运动缺陷突变菌株,确定其突变位点在基因组中的位置,并命名其为cdp A。Simple Modular Architecture Research Tool（SMART）蛋白分析表明,该蛋白结构域与Rpf R结构域相同。Rpf R可降解c-di-GMP,但是在B.cenocepacia H111内,Cdp A的功能尚不明确。在本论文中,我们对Cdp A与c-di-GMP信号之间的关联进行了详细研究,研究结果如下:1、发现Cdp A调控重要生物学功能。对cdp A基因进行敲除,cdp A突变体表现出群集运动、生物膜等生物学表型缺陷。过表达rpf R或cdp A基因到cdp A突变体中则能恢复cdp A突变体生物膜形成和群集运动缺陷。而过表达cdp A到rpf R突变体中,过表达菌株亦可基本恢复其群集运动和生物膜等表型缺陷。说明Cdp A和Rpf R均可以正调控群集运动和生物膜形成等表型。2、鉴定Cdp A的EAL结构域为其功能基团。单独过表达cdp A结构域基因cdp APAS、cdp AGGDEF和cdp AEAL到cdp A突变体中。结果显示,只有cdp AEAL可以部分恢复cdp A突变体表型缺陷。选取两个外源蛋白,Wsp R和Roc R,其中Roc R是c-di-GMP降解酶,而Wsp R为c-di-GMP合成酶。分别过表达wsp R和roc R到cdp A突变体中,结果表明过表达roc R可以大幅度恢复cdp A突变体的群集运动和生物被膜形成表型缺陷,而过表达wsp R则无此作用。EAL结构域被预测对c-di-GMP有PDE活性,说明Cdp A很有可能是一个c-di-GMP降解酶,且是EAL结构域在发挥作用。3、证实Cdp A为c-di-GMP降解酶。结果显示,在cdp A突变体中,和野生型相比,其胞内c-di-GMP的浓度显著上调。体外酶活反应表明,Cdp A重组蛋白可降解c-di-GMP,证明Cdp A有PDE活性。4、RNA-Seq转录组分析表明,和野生型H111相比,cdp A突变体中大量目标基因表达水平存在显著性差异。荧光定量PCR分析亦验证了数据的可靠性。在表达量受影响的基因中,包括一些与毒力相关的基因。毒力分析实验表明,cdp A突变体对细胞和小鼠的侵染能力下降,显示Cdp A影响B.cenocepacia毒力。本课题的研究工作提供了确切的研究结果来支持这些结论,即Cdp A作为c-di-GMP降解酶,在体内降解c-di-GMP信号。通过调控胞内c-di-GMP水平从而最终调控细菌的生理功能如群集运动、生物被膜形成和毒力。