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细胞维持基因组稳定性对细胞正常生命活动至关重要。组蛋白H2B单泛素化修饰对于促进DNA复制和修复、维持基因组稳定性具有重要作用。酿酒酵母细胞中,由E2结合酶Rad6和E3连接酶Bre1介导组蛋白H2B发生泛素化修饰。H2B泛素化作为一种独立的表观遗传修饰,如何响应DNA复制压力和修复等生物学过程尚不清楚。此外,Bre1在基因组稳定性过程中是否具有独立于H2B泛素化之外的功能也不清楚。本文就H2B泛素化修饰如何响应DNA复制与修复以及Bre1直接参与同源重组的功能与机制进行了深入探究,取得如下结果:(1)本研究以酿酒酵母为材料,通过对Bre1-3×FLAG亲和纯化分析,结合液相质谱、免疫共沉淀(Co-IP)及GST pull down等方法,发现Bre1与单链DNA结合蛋白-复制蛋白A(Replication Protein A,RPA)大亚基Rfa1存在直接互作,并且该相互作用在S/G2期以及DNA损伤试剂处理后有所增强。RPA参与DNA复制、转录和修复等DNA代谢相关过程。进一步,通过一系列pull down实验,本研究定位并确定了Bre1中L516,L518,D520,D522,L524,L525等氨基酸是介导Bre1与Rfa1相互作用的关键位点;同时,也鉴定了Rfa1中D465氨基酸是介导RPA与Bre1相互作用的关键位点。将上述氨基酸突变为丙氨酸(bre1-6A或rfa1-D465A)则破环RPA-Bre1在体内体外的互作。(2)Bre1介导的H2B泛素化促进正常的DNA复制。本研究首先检测了Bre1-RPA相互作用对二者在DNA复制叉处招募的影响。我们发现利用bre1-6A或rfa1-D465A点突变破坏Bre1与RPA的相互作用并不影响RPA在复制叉处的募集,但会导致Bre1蛋白在复制叉处的富集显著下降。相应地,破坏上述相互作用导致Bre1介导的组蛋白H2B泛素化水平在复制叉处显著下降。进一步,我们发现与野生型(WT)细胞相比,突变体bre1-6A与rfa1-D465A细胞周期明显滞后,DNA合成存在显著缺陷,并伴随着自发DNA损伤大量增加(7倍)以及响应复制压力缺陷。上述结果表明H2B泛素化在DNA复制过程中发挥功能依赖于Bre1-RPA相互作用。类似地,我们发现特异性破坏Bre1与RPA的相互作用并不损害RPA在DNA双链断裂处的募集,但会导致Bre1在DNA断裂处募集显著减少,H2B泛素化修饰不能发生,Rad51募集减少,最终导致同源重组修复受损。因此,Bre1介导的H2B泛素化在DNA复制和同源重组修复过程中发挥功能依赖于RPA与Bre1的相互作用及对Bre1的招募。这样,RPA介导的Bre1招募将H2B泛素化修饰与DNA复制和修复过程偶联起来。(3)氨基酸序列比对分析发现Bre1与Rfa1互作区域在物种进化中相对保守。利用GST pull down,我们证明了人类细胞中RNF20与RPA70之间存在直接互作,并在体外发现RNF20中氨基酸L805,E807,E809,L811和L812与RPA70中D460是介导二者互作的关键氨基酸位点,为研究人类细胞中RPA是否具有招募RNF20的功能奠定基础。(4)同时,结合Co-IP及GST pull down技术,证明了Bre1与Rad51之间存在直接互作,并鉴定了Bre1中氨基酸E500及K502是介导Bre1-Rad51相互作用的关键位点。突变体bre1-EK对DNA损伤试剂呈现出不同程度的敏感性,且同源重组效率下降至60%。由染色质免疫共沉淀实验表明Bre1-Rad51相互作用不影响Bre1在DNA双链断裂末端的招募,也不影响局部H2B泛素化修饰,同时在体外证明bre1-EK不影响Bre1 E3连接酶活性。(5)本研究进一步通过体内外实验揭示Bre1-Rad51相互作用有助于Rad51替代已结合至ss DNA上的RPA,从而使得Rad51-ss DNA核蛋白丝稳定存在以促进Rad51发生链交换反应;同时发现Bre1能够有效抑制Rad51结合ds DNA。最后,本研究发现Bre1能够通过ss DNA介导与Srs2相互作用并促使Srs2从ss DNA上解离。Bre1通过拮抗Srs2结合ss DNA进一步保护Rad51-ss DNA核蛋白丝稳定避免Srs2对Rad51-ss DNA核蛋白丝的破坏。综上所述,本研究阐明了H2B泛素化与DNA复制与修复偶联的分子机制,同时揭示了Bre1在同源重组过程中具有重组中介蛋白的功能,为深入理解RNF20在人类细胞中的功能与机制奠定了基础。