猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病。机体感染PRRSV后,诱导迟缓、低水平的中和抗体,而且病毒在机体内持续感染并引起免疫抑制。PRRSV结构蛋白及非结构蛋白在免疫抑制中发挥重要作用。GP5是由PRRSV的ORF5编码的含有4个糖基化位和6个抗原决定簇的糖基化囊膜蛋白,是诱导中和抗体产生的主要结构蛋白。GP5是PRRSV结构蛋白中变异最大的蛋白,其编码201个氨基酸共603bp,对其序列进行研究与分析发现其第229-246位氨基酸残基含有ITIM抑制基序。机体对外界环境的免疫应答过程能保持适当的强度有赖于负反馈系统的调节,而免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)在负向调节中发挥决定性作用。ITIM基序中酪氨酸的磷酸化是免疫抑制信号转导过程中最关键的步骤。活化后的ITIM可以成为含SH2结构域的酪氨酸磷酸酶(SHP-l,SHP-2,SHIP)的潜在结合位点。当抑制途径被激活后,ITIM可以和SHP-l/SHP-2的SH2结构域相结合而使SHP-l/SHP-2活化。为了揭示PRRSV逃避天然免疫的机制,本文对含ITIM基序的GP5蛋白介导的信号通路进行了初步的探索研究。具体内容如下:试验一应用RT-PCR技术从Marc145细胞中克隆出SHP-1、SHP-2结构域基因的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-SHP-1、pET-SHP-2,转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下成功表达分子质量大小约为37.5KD、40.1KD的融合蛋白,将纯化过的融合蛋白分别免疫小鼠,制备鼠源血清,采用间接ELISA和Western blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1:12800;Western blotting试验结果证明,制备的鼠抗pET-SHP-1、p ET-SHP-2多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。采用硫酸铵盐析与DE-52离子交换层析相结合的方法提取并纯化血清得到纯度较高的鼠抗SHP-1、SHP-2抗体IgG。结果验证了Marc145细胞SHP-1、SHP-2的存在,克隆出了Marc145细胞SHP-1、SHP-2结构域基因并成功表达,为后续试验和研究奠定了基础。试验二通过对GP5基因序列的研究与分析,结合后续的实验要求,应用RT-PCR技术克隆出GP5基因的cDNA序列并测序进行分析比对,对GP5基因进行克隆并表达,通过基因重组技术和重叠延伸PCR技术成功构建了GP5基因的真核表达载体pcDNA-GP5和缺失ITIM基序的pcDNA-GP5△229-246。为后期ITIM基序的研究奠定了坚实的基础。试验三通过PRRSV感染Marc145细胞和运用脂质体转染法将成功构建的pcDNA-GP5、pcDNA-GP5△229-246真核表达质粒转染到Marc145细胞,用本试验建立的real-time PCR方法检测Marc145细胞中SHP-1、SHP-2、IFN-β、NF-κB mRNA转录水平,运用RT-PCR和Western blotting技术从mRNA和蛋白水平共同验证了GP5和GP5△229-246在Marc145细胞中得到有效表达。用本试验建立的real-time PCR方法检测pcDNA-GP5及pcDNA-GP5△229-246转染Marc145细胞中SHP-1、SHP-2、IFN-β、NF-κB mRNA转录水平的影响结果表明GP5蛋白的ITIM基序可显著下调SHP-1的转录水平,表明GP5蛋白的ITIM基序可抑制SHP-1;而GP5蛋白的ITIM基序总体可显著上调SHP-2的转录水平且在早期明显升高,表明GP5蛋白的ITIM基序可激活SHP-2,使其介导下游信号去磷酸化来发挥功能作用;同时,试验结果表明GP5蛋白的ITIM基序在24h可显著下调IFN-β的转录水平,而在36h又显著上调IFN-β的转录水平,48h IFN-β的转录水平趋于稳定并有降低趋势,说明GP5蛋白的ITIM基序对IFN-β的抑制作用有一定的时间限制;然而,对于NF-κB的研究我们不难看出,GP5蛋白的ITIM基序在不同时间段可显著下调NF-κB的转录水平,对NF-κB有明显的抑制作用。因此,含ITIM基序的GP5蛋白可能以依赖ITIM磷酸化的方式与宿主胞内酪氨酸磷酸酶SHP-1/SHP-2互作,促进SHP-1/SHP-2招募到TRAF6适配体蛋白上,从而抑制TRAF6的泛素化,进而抑制NF-κB和MAP激酶的激活。但GP5蛋白的ITIM基序下调SHP-1转录水平,而GP5蛋白的ITIM基序上调SHP-2转录水平并激活SHP-2,而GP5蛋白的ITIM基序在不同时间段对NF-κB有明显的抑制作用,表明SHP-2在Marc145细胞负调控中可能起主要作用。