研究背景:卵巢癌(ovariancancer)是世界范围内常见的妇科恶性肿瘤之一,受卫生及生活条件的影响,我国是卵巢癌发病的重灾区之一。随着医疗技术的不断发展,尽管卵巢癌的诊疗方法取得了不断的进步,但卵巢癌患者的预后仍不乐观,晚期卵巢癌患者的5年生存率仅有40%左右。肿瘤转移(metastasis)是肿瘤进一步发展的重要过程,造成肿瘤相关死亡的首要因素。近年来的研究表明,肿瘤微环境在肿瘤的转移过程中发挥重要作用。学者们的研究发现卵巢癌细胞能够与肿瘤微环境相互作用,促进卵巢癌的发生发展、免疫抑制、转移复发等过程。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境的重要组成部分,肿瘤相关的巨噬细胞按照功能可将其分为M1型和M2型两种。其中M1型在体外可有γ干扰素(IFNy)或者肿瘤坏死因子α(TNFα)进行诱导,释放炎性因子IL6,IL12,IL23等主要生物学功能在于杀伤肿瘤细胞及病原体。M2型巨噬细胞可有转化生长因子TGFβ、IL4和IL13等刺激诱导,主要分泌多种生长因子促进肿瘤的生长和血管的形成。在巨噬细胞与癌细胞的相互作用过程中,卵巢癌细胞在这些刺激下还能够分泌大量的活性物质,调控肿瘤微环境的变化,来进一步促进卵巢癌的生长、侵袭和转移等生物学活动。因此,研究卵巢癌肿瘤微环境与肿瘤细胞之间相互作用,对深入了解卵巢癌的发展机制、优化卵巢癌的诊疗策略及寻找卵巢癌治疗的新靶点等都具有重要意义。CXCL16是CXC趋化因子家族的一员,生理状态下存在两种表现形式:膜结合型和分泌型。正常情况下,CXCL16主要在CD8+T细胞、Th细胞、自然杀伤T细胞及巨噬细胞中中表达,而其唯一受体CXCR6则主要表达在未分化的CD8+T细胞、自然杀伤T细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞中。早期的研究表明,CXCL16/CXCR6在细胞黏附、炎症反应、胸腺T细胞发育及免疫应答方面发挥重要作用,且研究内容主要集中在炎症及免疫相关的疾病中,如风湿性关节炎、动脉粥样硬化、HIV感染、肝炎、肺炎等。近年来的研究发现,在多种恶性肿瘤细胞中均存在CXCL16及CXCR6表达异常高表达的现象,与肿瘤的增殖、转移、侵袭及患者预后密切相关。提示CXCL16/CXCR6轴在肿瘤的发展过程中可能发挥重要作用。但目前关于CXCL16/CXCR6轴在卵巢癌与巨噬细胞相互作用过程的生物学机制仍鲜有报道。鉴于此,本研究首先对卵巢癌组织中CXCL16和CXCR6的表达水平及巨噬细胞的活性进行了检测。然后通过巨噬细胞与卵巢癌细胞系SKOV3细胞共培养模拟卵巢癌肿瘤微环境,进一步研究CXCL16/CXCR6在SKOV3细胞与巨噬细胞作用过程中的生物学功能及下游分子机制,为卵巢癌机制的深入研究、临床治疗方案的优化,乃至新型靶向药物的开发提供新的思路和数据支持。研究目的1、检测卵巢癌癌组织及癌旁组织中CXCL16、CXCR6的表达水平及巨噬细胞的活化水平,并研究CXCL16/CXCR6轴表达水平与巨噬细胞活性之间的关系;2、研究卵巢癌细胞与巨噬细胞相互作用过程中CXCL16、CXCR6及下游信号通路的变化及其对卵巢癌细胞生物学功能的影响;3、在卵巢癌细胞中敲低CXCR6表达后,研究CXCL16及下游信号通路的变化,明晰CXCL16/CXCR6在卵巢癌细胞侵袭和迁移过程中生物学意义;4、利用特异性抑制剂调控可能的CXCL16/CXCR6的下游信号通路,进一步确认CXCL16/CXCR6通过哪些信号通路参与调控卵巢癌细胞的侵袭和迁移活动。研究方法1、卵巢癌中CXCL16/CXCR6的表达及巨噬细胞活性的相关性选择20例卵巢癌患者为研究对象,收集患者的卵巢癌及癌旁组织,采用TRIzol方法提取组织总RNA,荧光定量PCR检测组织中CXCL16、CXCR6及巨噬细胞活性标志物TNF-α及IL-6的表达水平。同时采用western blotting检测CXCL16、CXCR6和TNF-α下游NF-κB的蛋白表达水平。采用pearson方法检测CXCR6表达水平与CXCL16、TNF-α及IL-6表达的相关性。2、卵巢癌细胞与巨噬细胞相互作用过程中CXCL16/CXCR6生物学功能采用卵巢癌细胞株SKOV3与TNF-α及THP-1细胞构建共培养体系模拟肿瘤微环境中SKOV3与巨噬细胞的相互作用。然后将细胞分组为:①SKOV3;②SKOV3+低浓度TNF-α;③SKOV3+巨噬细胞+低浓度TNF-α,检测SKOV3细胞中CXCL16、CXCR6和NF-κB表达水平、PI3K和Akt磷酸化水平及SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭变化。3、CXCR6敲低后对卵巢癌细胞生物学功能的影响利用siRNA技术敲低SKOV3细胞中的CXCR6的表达水平,将细胞分为:①SKOV3+巨噬细胞+低浓度TNF-α;②SKOV3+siRNAl+巨噬细胞+低浓度TNF-α;③SKOV3+siRNA2+巨噬细胞+低浓度TNF-α。检测SKOV3细胞中CXCL16、CXCR6和NF-κB表达水平、PI3K和Akt磷酸化水平及SKOV3细胞的迁移和侵袭变化。4、特异性抑制CXCL16/CXCR6下游信号通路对巨噬细胞共培养诱导下卵巢癌细胞生物学功能的影响选用PI3K和Akt特异的抑制剂LY294002和MK-2206特异性阻滞PI3K和Akt信号通路,将细胞分组为:①SKOV3+巨噬细胞+低浓度TNF-α;②SKOV3+PI3K抑制剂(LY294002)+巨噬细胞+低浓度TNF-α;③SKOV3+AKT抑制剂(MK-2206 2HCl)+巨噬细胞+低浓度TNF-α。检测检测SKOV3细胞中CXCL16、CXCR6和NF-κB表达水平、PI3K和Akt磷酸化水平及SKOV3细胞的迁移和侵袭变化。研究结果1、卵巢癌中CXCL16/CXCR6的表达及巨噬细胞活性的相关性(1)CXCL16、CXCR6、TNF-α和IL-6在卵巢癌组织中的mRNA表达水平显著高于癌旁组织;(2)CXCL16、CXCR6和NF-κκBp65在卵巢癌组织中的蛋白表达水平显著高于癌旁组织;(3)CXCR6的表达水平与CXCL16、TNF-α和IL-6表达水平呈显著正相关关系。2、卵巢癌细胞与巨噬细胞相互作用过程中CXCL16/CXCR6生物学功能(1)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养促进SKOV3细胞CXCL16的分泌水平;(2)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养促进SKOV3细胞中的CXCL16和CXCR6的mRNA表达水平;(3)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养促进SKOV3细胞中CXCL16、CXCR6和NF-κB p65的蛋白表达水平;(4)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养96小时后显著抑制SKOV3细胞的增殖能力;(5)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养显著促进SKOV3细胞中PI3K和Akt的磷酸化水平;(6)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养显著促进SKOV3细胞的迁移和侵袭能力。3、CXCR6敲低后对卵巢癌细胞生物学功能的影响(1)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养体系中,敲低CXCR6对SKOV3细胞中CXCL16的分泌水平及mRNA表达水平无显著影响;(2)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养体系中,敲低CXCR6显著下调SKOV3细胞中NF-κB p65的表达水平和PI3K及Akt的磷酸化水平;(3)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养体系中,敲低CXCR6显著下调SKOV3细胞的侵袭和迁移能力。4、特异性抑制CXCL16/CXCR6下游信号通路对巨噬细胞共培养诱导下卵巢癌生物学功能的影响(1)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养体系中,特异性抑制PI3K或Akt的活性显著下调CXCR6的表达水平,但对CXCL16的表达水平无显著影响;(2)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养体系中,特异性抑制PI3K或Akt的活性显著下调CXCR6及NF-κB p65的蛋白表达水平;(3)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养体系中,特异性抑制PI3K或Akt的活性显著下调PI3K和Akt的磷酸化水平;(4)SKOV3细胞与巨噬细胞共培养体系中,特异性抑制PI3K或Akt的活性显著下调巨噬细胞共培养下的SKOV3细胞侵袭和迁移能力。结论:1、与癌旁组织相比,CXCL16及CXCR6在卵巢癌中显著高表达,且其表达活性与肿瘤相关的巨噬细胞的活性呈正相关关系;2、肿瘤相关巨噬细胞提高SKOV3细胞中CXCL16和CXCR6的表达及下游PI3K/Akt信号通路,促进SKOV3细胞的侵袭和迁移;3、敲低SKOV3细胞中CXCR6的表达能够降低SKOV3细胞中PI3K和Akt的磷酸化水平,削弱SKOV3细胞的侵袭和迁移能力;4、特异性抑制PI3K或Akt信号通路能够显著降低巨噬细胞对SKOV3细胞的侵袭和迁移能力的影响并下调CXCR6的表达水平。创新之处1、本研究首次研究了趋化因子CXCL16及其受体CXCR6在卵巢癌中表达情况与巨噬细胞活性之间的关系,为深入探究卵巢癌的发展过程提供数据支持;2、本研究通过外源性细胞构建了共培养体系模拟卵巢癌肿瘤微环境,发现CXCL16/CXCR6在卵巢癌细胞与巨噬细胞相互作用过程中的分子机制,为卵巢癌的分子机制研究和新型靶向药物的开发奠定了基础。