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研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是最常见的神经退行性疾病之一,65岁及以上人群患病率约为1%。目前针对帕金森病的治疗方法仅能针对运动症状,无法阻止疾病发展。近年来,已有许多研究探索了多种神经保护和神经再生分子的治疗潜力,例如神经营养因子,抗氧化剂和RNA。在过去的十年中,已证明微米和纳米颗粒是将这些分子作用于大脑的强大工具,从而可以制定针对PD治疗的新策略。microRNA是大小为19至25个核苷酸的短RNA分子,可调节靶基因的转录后沉默。单个miRNA可以靶向数百个mRNA,并影响许多参与功能性相互作用途径的基因表达。miR-7主要在脑中表达,靶向帕金森病的主要病理性蛋白α-Syn mRNA、氧化应激重要调控因子Keap1 mRNA等,在减少胞内α-Syn、抵御ROS等方面具有重要作用。纳米金刚石（Nanodiamonds,NDs）具有理想纳米颗粒所需的功能:纳米级尺寸,稳定和惰性的核,表面修饰可调节,可有固有荧光且无光漂白,其毒性可忽略不计,并且可与药物形成复合物。这些独特的理化特性突出了NDs在载药治疗上的潜力。本研究旨在以NDs为载体、miR-7为核酸药物,制备NDs-miR-7纳米复合物探索其在帕金森病模型中的保护作用及机制。目的microRNA在基因治疗方面具有极大潜力,miR-7是治疗PD的强有力工具。为探索一种便捷有效的microRNA递送方式,本研究拟构建NDs-miR-7纳米复合物,检测其物理特性、生物安全性、递送优势,探讨该复合物对MPP+构建的SH-SY5Y细胞PD模型的保护作用和机制,为治疗帕金森病提供一个新思路。方法1.凝胶阻滞实验确定NDs∶miRNA最佳复合质量比;粒度仪检测纳米复合物水合粒径,透射电镜（TEM）观察纳米复合物形状及直径。2.CCK-8试剂盒检测经NDs、miR-7、NDs-miR-7共孵育后人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞的存活率。3.流式细胞术及激光扫描共聚焦显微镜检测不同时间NDs-Cy5-miR-7的细胞摄取及入胞效率,阳性对照为脂质体转染试剂Lipofectamine RNAiMAX搭载miR-7;qRT-PCR检测细胞摄取miR-7后的胞内相对miR-7量。4.SNCA-EGFP质粒转染SH-SY5Y细胞使其过表达α-Syn蛋白,后与NDs-miR-7共孵育24 h,激光共聚焦显微镜观察EGFP荧光。5.不同浓度（0 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM、1 mM）MPP+诱导SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型,CCK-8试剂盒检测SH-SY5Y细胞存活率以确定最佳MPP+浓度。6.MPP+构建SH-SY5Y细胞PD模型,NDs-miR-7与其共孵育24h,WB检测TH蛋白水平,qRT-PCR检测TH基因表达水平。7.荧光探针DCFH-DA检测细胞活性氧水平。结果1.NDs与miR质量比为20∶1共孵育10 min时即可完全复合。NDs颗粒水合粒径为47.6 nm,透射电镜下呈圆形/球形,直径为5～10 nm;NDs-miR复合物水合粒径为225.4 nm,透射电镜下呈圆形/球形,约15～20 nm。2.低浓度NDs（5μg/mL）对细胞活性无影响;使用脂质体转染的miR-7在低浓度（5 nM、10 nM、50 nM）时促进细胞生长。NDs-miR-7、Lipo-miR-7（miR-710 nM）促进细胞生长。3.低浓度FND孵育的MN9D细胞摄取率在1～4 h逐步上升,在4～24 h趋于平稳,之后便逐步下降,至48 h时最终摄取FND的细胞数量为9.34%;高浓度FND（20μg/mL）孵育较低浓度（5μg/mL）孵育的MN9D细胞的细胞摄取速率更快,并且在1 h时已达20%,随着孵育时间延长,已摄取FND的细胞数量逐渐增多,并在12 h时到达摄取高峰,FND阳性细胞率为12.29%,之后摄取率逐渐下降,直至24 h高浓度FND孵育的MN9D细胞最终摄取FND的细胞数量为31.86%。4.NDs-Cy5-miR在与MN9D细胞共孵育1 h时已有超过50%的细胞摄取,直至24 h Cy5阳性细胞率均较高;与此相比脂质体转染试剂与Cy5-miR复合后与MN9D细胞共孵育1～2 h时达50%阳性率,2～12 h维持,至24 h时Cy5阳性细胞率最高达90%左右。激光共聚焦显微镜下观察其Cy5荧光也具有同样结果。qRT-PCR结果显示,miR-7与SH-SY5Y细胞共孵育24 h后,细胞内miR-7相对表达量与对照组并无差异,Lipo-miR-7、NDs-miR-7与SH-SY5Y细胞共孵育24 h后,其miR-7细胞内表达量远高于对照组;并且miR-7经NDs复合后,其转染效果优于Lipofectamine RNAiMAX。5.NDs-miR-7对α-Syn表达的影响:NDs-miR-7能够减少过表达α-Syn的HEK293T细胞中α-Syn的表达。6.建立PD细胞模型:随着MPP+浓度逐渐增加,SH-SY5Y细胞存活率逐渐下降（P＜0.05）。在浓度为1 mM时细胞存活率为50%左右,细胞毒性作用明显,故后续实验采用1 mM浓度的MPP+诱导建立PD细胞模型。7.NDs-miR-7对PD的保护作用:SH-SY5Y细胞经NDs-miR-7（miR-7 10 nM）预处理并经MPP+诱导后,与MPP+模型组相比,细胞活性明显上升,TH蛋白水平回升,TH表达增加;NDs-miR-7的保护作用与Lipo-miR-7相似。8.氧化应激水平:NDs-miR-7回救了MPP+提升的ROS水平。结论为探讨纳米金刚石NDs搭载miR-7后对PD细胞模型的保护作用,本研究首先构建了NDs-miR-7纳米复合物,对其进行表征及生物相容性分析,表明该NDs能够与miR-7复合并且安全无毒。随后探索了NDs-miR-7纳米复合物的细胞摄取及胞内表达,表明NDs搭载miR-7入胞在速率及表达量上优于脂质体转染方法。NDs-miR-7与SNCA过表达的293T细胞共孵育后能够抑制α-Syn的表达,表明NDs-miR-7的靶向性并能够降低细胞α-Syn的表达。最后通过构建MPP+诱导的PD细胞模型证明,NDs-miR-7可回救MPP+诱导的PD细胞模型的TH水平,通过下调ROS水平,降低PD细胞模型氧化应激起到保护作用,为缓解和治疗PD提供了新的策略和潜在的可能性。