【摘 要】
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作为一类色素,类胡萝卜素具有高效的抗氧化、抗衰老及防癌抗癌功能,被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域中。三孢布拉霉(Blakeslea trispora)可以大量合成β-胡萝卜素,其合
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作为一类色素,类胡萝卜素具有高效的抗氧化、抗衰老及防癌抗癌功能,被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域中。三孢布拉霉(Blakeslea trispora)可以大量合成β-胡萝卜素,其合成过程受到光调控。然而,关于光调控三孢布拉霉合成类胡萝卜素的生理过程及其分子机制鲜有报道。本课题针对目前的研究现状,从三孢布拉霉的光受体入手,分离并鉴定了三孢布拉霉中的光受体蛋白Blakeslea trispora White Collar-1(BTWC-1),针对光受体蛋白的结构和功能展开了系统性的研究,以期为三孢布拉霉中光调控的生理学和分子生物学奠定一定基础。本研究的具体内容如下:1)BTWC-1的基因克隆、生物信息学分析与异源表达。克隆获得了三种光受体蛋白,分别命名为BTWC-1A、BTWC-1B和BTWC-1C,对BTWC-1的生物信息学分析表明,它们的功能结构域(Light-Oxygen-Volt(LOV)结构域和锌指结构域)与其他真菌中的光受体蛋白高度同源,初步确定BTWC-1是三孢布拉霉中的光受体蛋白。同时,在大肠杆菌中异源表达获得了光受体蛋白BTWC-1。2)BTWC-1感光作用的体外分析。利用高效液相色谱法和荧光光谱法确定BTWC-1蛋白缀合色素基团黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)。将BTWC-1蛋白纯化后,进行了其在黑暗和光照下的吸光度变化分析,发现BTWC-1对光存在响应,在光诱导下经历了一个规律性的光响应的循环周期。对BTWC-1 LOV结构域α?A螺旋上的半胱氨酸残基(Cysteine,Cys)进行了定点突变,结果表明该突变不影响其在大肠杆菌中正常表达,但会导致光响应的丧失,证明该Cys残基是发挥感光作用的色素基团缀合位点。3)基于卷枝毛霉(Mucor circinelloides)光受体敲除株的BTWC-1体内功能的初步分析。通过回补btwc-1到对应的敲除mcwc-1基因的卷枝毛霉敲除株中,初步分析了BTWC-1蛋白的体内功能。回补了btwc-1a的回补株R-MU242恢复了mcwc-1a敲除株MU242失去的向光性,而回补了btwc-1c的回补株R-MU247在光照下恢复了mcwc-1c敲除株MU247缺失的β-胡萝卜素生物合成功能。这些结果表明,btwc-1a和btwc-1c分别参与了三孢布拉霉菌丝体的向光性和光诱导三孢布拉霉类胡萝卜素合成的调节机制生理过程。
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