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β-内酰胺抗生素的生产正经历一场从化学法制备向酶法制备转变的技术变革。青霉素G酰化酶（Penicillin G acylase, PGA）在酶法制备技术中处于核心地位。提高PGA的合成活力将推进β-内酰胺抗生素的酶法合成。目前基因序列已知的PGA分别来源于革兰氏阴性菌 （Alcaligenes faecalis (Af), Escherichia coli (Ec), Kluyvera citrophila (Kc), Providencia rettgeri (Pr)）以及革兰氏阳性菌（Bacillus megaterium (Bm) , Arthrobacter viscosus）。同属革兰氏阴性菌或者革兰氏阳性菌的PGA同源性较高，酶学性质接近。利用定向进化技术对pga基因进行随机突变和同源重组，有望获得具有更高合成活力和更高稳定性的新突变酶。论文第一章构建了PGA的枯草芽孢杆菌分泌表达系统。克隆了来源于Alcaligenes faecalis (CICC AS1.767)的pga基因（Genbank 登录号AF455356），该基因在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达。表达量较野生型AfPGA提高109倍。表达产物经纯化活力回收率达到81%，比活力为1.469U/mg。确定了该酶的最适温度和最适pH，证明AfPGA的合成能力有限但是对有机溶剂有较强的稳定性。第二章针对提高AfPGA的表达量和构建枯草芽孢杆菌通用表达质粒进行了研究。结合SignalP对信号肽序列的分析结果改造BmPGA的信号肽。在此基础上研究了枯草芽孢杆菌启动子HpaⅡ、p43和信号肽BmPGAsp、AfPGAsp、 SacB对枯草芽孢杆菌表达AfPGA的影响，发现不同启动子和信号肽的组合对AfPGA表达水平的影响有明显差异。第三章构建了PGA的大肠杆菌表达系统。克隆了Providencia rettgeri (ATCC29944) PGA的C端突变基因（GenBank 登录号AF499615）。利用T7<WP=3>启动子实现了该基因在大肠杆菌中的表达，基因工程菌表达量较野生型PrPGA提高了66倍。在此基础上分别构建了表达AfPGA，EcPGA，KcPGA和PrPGA的大肠杆菌工程菌，分析了发酵条件对大肠杆菌表达PGA的影响。第四章研究了PGA的噬菌体展示。将包含信号肽和琥珀终止密码子的完整巨大芽孢杆菌pga基因克隆到噬菌粒pSurfscript，通过引入的11肽连接PGA的C末端与噬菌体外壳蛋白gp3的N末端。构建的噬菌粒pSurfpga转化具有琥珀突变的大肠杆菌XL1-blue，以辅助噬菌体M13KO7超感染，在噬菌体表面展示出有活力的BmPGA。为大规模筛选与特异性底物结合的突变酶奠定了基础。第五章在上述研究的基础上，着重研究了PGA的DNA家族重排。DNA家族重排是定向进化的代表技术。定向进化模拟自然进化的过程，能够大大加速酶的功能进化。利用DNA重排技术随机突变BmPGA β亚基序列，利用枯草芽孢杆菌表达突变库并筛选突变酶。序列测定结果表明随机突变率为1.07%。在此基础上，选择序列同源性为62.5%~96.9%的EcPGA，KcPGA和PrPGA基因，以PrPGA基因为基本骨架，利用DNA家族重排技术构建了上述基因的多基因突变库。利用大肠杆菌表达突变库，通过平板筛选和HPLC分析测定突变酶的合成水解活力比。测序结果表明多基因嵌合体突变库显示出明显的多样性。通过一轮DNA重排，获得了合成活力比PrPGA提高40%的突变酶，并且发现α亚基的重排对酶合成活力的提高更加有效。