改良诱导方法使脂肪间充质干细胞具有成熟施旺细胞分子特性并促进周围神经再生

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目的:组织工程技术为周围神经损伤研究提供了新的治疗策略。施旺细胞(Schwann cells,SCs)在神经再生的细胞相关性治疗中发挥着重要作用。研究发现脂肪间充质干细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)可以诱导分化为SCs,但是其SC分子表型及功能特性仍不甚满意,并且在撤去诱导培养基后,难以长时间维持。在SCs培养中,胰岛素、孕酮及糖皮质激素均可以促进髓鞘形成及神经营养因子分泌。故此,我们探究在传统诱导方法上同时联用胰岛素、孕酮及糖皮质激素是否可以诱导ADSCs分化为具有更好分子及功能特性的SCs。
  方法:通过流式细胞学及成骨成脂诱导染色鉴定出人源ADSCs。在传统诱导分化基础上同时加入胰岛素、孕酮及糖皮质激素。通过实时定量聚合酶链式反应、酶联免疫吸附实验和免疫荧光等技术,明确改良诱导培养基(modified differentiation medium, MDM)及传统诱导培养基(original differentiation medium, ODM)培养出的SCs的分子表型与神经营养因子表达水平。并且在撤去诱导培养基后,通过四甲基偶氮唑蓝法与迁移实验、实时定量聚合酶链式反应、酶联免疫吸附实验和免疫印迹实验来评估诱导形成的SCs的增殖迁移能力、SC分子表型稳定性及神经营养因子表达情况。体内试验中,将细胞搭载到由胶原蛋白海绵组成的神经修复生物材料上,用以修复10-mm长的坐骨神经缺损。通过再生神经组织免疫荧光、腓肠肌湿重、腓肠肌Masson染色及步态分析实验,来评估轴突的再生情况与再生神经的功能恢复程度。
  结果:成功提取鉴定了高纯度人源ADSCs。通过诱导分化,MDM培养的SCs中S100B和P0基因明显上调,细胞增殖与迁移能力明显提高。相较于ODM,MDM培养的SCs的神经营养因子分泌能力明显增强,并且其功特性可以在撤去诱导培养基后维持超过3周。体内实验中,组织工程化神经可以明显促进SD大鼠坐骨神经损伤后的修复。神经组织免疫荧光实验证实与ODM相比,MDM培养出的SCs可以明显促进损伤神经轴突的再生及髓鞘形成,并可能通过分泌神经营养因子的方式发挥作用。术后16周,移植了改良方法诱导SCs的大鼠展现出最好的坐骨神经功能恢复效果。差异均有统计学意义(P<0.05)。
  结论:实验结果表明相对于传统诱导方法,MDM能够将人ADSCs诱导分化为具有成熟SC分子表型和功能特性的SCs,并可在撤去诱导培养基后长期维持其特性。其构建的组织工程化神经可以有效促进周围神经再生,为未来的临床治疗提供新的实验及理论基础。
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